1.菌液接种到500ml培养基中，加抗生素至工作浓度，37℃，300rpm过夜2.4000rpm，15min离心菌液收集菌体。

3.用20ml solutionⅠ溶解菌团，充分打散混合均匀。

4.称取0.1g溶菌酶加入菌液，室温放置5min。

5.加入40ml solution Ⅱ，轻轻混合至澄清,冰上放置5min。

6.加30ml solution Ⅲ，轻轻混匀，冰浴10min。

7.4000rpm，20min，离心后将上清液倒到200ml量筒里面。

8.加入0.6倍体积的异丙醇混匀并室温放置10min。

10000rpm离心15min。

9.用6.5ml的TE重悬沉淀，转移到4个EP管中，13000rpm 离心5min。

10.上清转移到15ml的离心管中，加7.2gCsCl和 200ul的10mg/ml的EB，混匀。

11.在超速离心管中加样并封口。

60000rpm 10℃离心16h。

12.用一个注射器在超速离心管中上面戳一个孔，留下针头，并用另外一个注射器从红色质粒带旁边管壁戳进去，吸取1-1.5ml，装入新的离心管中。

13.加5ml TE饱和丁醇，混匀后静置各相分离后去掉上层桃红色丁醇，重复这一步，直到下层水相中没有桃红色。

转移下层水相到EP管中。

14.加入1/10体积5M的Nacl和2倍体积的无水乙醇。

在-20℃下放置20min。

15.13000rpm，10min离心后去上清，重悬沉淀于1ml的TE然后转移至EP管。

16.用1倍体积的25/24/1的酚/氯仿/异戊醇抽提两次。

17.每管加1/10体积的2.5M的乙酸钠和2倍体积的乙醇， -20℃下放置20min。

13000rpm离心10min，然后用70%的乙醇轻轻润洗并晾干EP管。

18.重悬于1ml TE中，并在OD260下测量浓度。

LB培养基配方：试剂1LTryptone(胰蛋白胨) 10gYeast extract（酵母膏；酵母提取物）5gNaCl 5gAgar（琼脂糖）15g碱裂解法原理：本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。

十二烷基磺酸钠（SDS）一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

1、用SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒 DNA和染色体 DNA 两种 DNA 在强碱环境都会变性。

2、当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值后，质粒 DNA 迅速复性，而染色体 DNA 分子巨大，难以复性。

3、通过离心，大部分细胞碎片、染色体 DNA RNA 及蛋白质沉淀（ SDS 的作用下）除去，而质粒 DNA 留在上清中。

4、再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA 。

实验内容所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：1、培养细菌使质粒扩增。

2、收集和裂解细菌。

3、分离和纯化质粒DNA。

影响质粒提取的因素：宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒的拷贝数，质粒的稳定性，抗生素，吸附柱的吸附量等。

宿主菌的种类：一般从宿主菌如DH5α，TOP10中可以得到高质量的质粒DNA，但也有些菌株有非常高的内切酶活性或裂解时产生大量的糖类，会降低质粒得率。

培养时间：一般过夜（12-16h），最好不要超过16h，因为这时抗性开始下降，细胞开始裂解，使得质粒得率降低，也会导致质粒丢失或变异。

抗生素：在菌株的各阶段都应加入抗生素筛选，因为无质粒的细胞在无抗生素性时复制速度远大于含质粒的细胞。

抗生素贮存浓度（mg/ml）保存条件（℃）严紧型质粒（ug/ml）松弛型质粒（ug/ml）氨苄青霉素50（溶于水）-20 20 100羧苄青霉素50（溶于水）-20 20 100 氯霉素34（溶于无水乙醇）-20 34 170 卡那霉素10（溶于水）-20 10 50 链霉素10（溶于水）-20 10 50 四环素5（溶于无水乙醇）-20 10 50质粒提取常见问题：Q1：未提出质粒或得率低？A1：大肠杆菌老化。

重新涂平板，挑新克隆A2：菌体中无质粒。

有些质粒不能在某些菌体中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。

A3：碱裂解不充分。

菌体过多导致裂解不充分，加倍Solution I，II，III的量。

A4：乙醇残留。

漂洗液洗涤后应离心尽量除出残留液体，再加入洗脱液洗脱。

Q2：质粒纯度不高？A1：混有蛋白。

不要使用过多菌体。

A2：基因组DNA污染。

加入Solution II，III后应温和混匀；不要剧烈震荡。

A3：加入Solution IIII不要过长，否则可能会有小片段DNA污染。

质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。

是一种环状的双链DNA分子。

存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

质粒具有自主复制性、不相容性、多拷贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切酶单一识别位点等特点。

它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒类型：1、严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。

所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；2、松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。

如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

质粒提取的原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。

碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-ClpH 8.0 / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸溶液I的作用:适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液：控制好溶液的pH。

葡萄糖:加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。

EDTA: EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。

溶液II的作用：NaOH：破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。

SDS：也是碱性的，只是弱了点而已。

很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。

有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞。

SDS为下一步操作做的铺垫。

这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

溶液III的作用：乙酸钾：加入后就会有大量的沉淀，大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。

如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。

既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。

因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。

但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。

这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。

如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。

大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。

这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

醋酸：是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。

基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。

所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。

NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。

溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

酚/氯仿/异戊醇：不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用进行酚/氯仿/异戊醇抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。

这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。

酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。

至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。

这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。

高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。