RNase A：10mg/ml
操作步骤及注意事项
1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中， 于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不能太长，否则细
菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。
2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可 能流尽。 3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振 荡，使菌体分散混匀。 4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要 剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞 膜裂解,DNA变性。-放置时间不能太长。因为在碱性条件下
1。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清
不要随便丢弃，应存放在一起进行灭菌处理，以免污染环境。
2。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿 异戊 醇时要在通风橱中进行，氯仿 可引起神经系统功能紊乱要引起 肝脏损害 。异戊醇其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有 刺激作用
3。电泳时注意避免EB污染。
基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋 白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加 入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏 但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心 时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后 形成PDS被离心时可沉淀下来。
PCR技术
❖ 基本原理 ❖ 反应动力学 ❖ 使用步骤及注意事项 ❖ 反应参数要素 ❖ PCR优化
PCR技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年 代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、 敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化
等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因 或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使
作用沉淀
4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白，为
tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降 低表面张力，可以减少泡沫
5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的
带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
实验室安全：
同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。 6.12000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚/氯仿 /异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。-抽提掉
剩余蛋白。
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入0.5~0.7 倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。-可
以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太 久
取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。其次操作 过程注意：避免基因组断裂，除净蛋白，盐离子清洗干净。
质粒数量：同量摇菌量中质粒量取决于质粒拷贝数。低拷贝 数质粒可以通过添加氯霉素来增大拷贝数。
2。阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。
溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与 NaOH作用,减弱了其碱性。
肉眼能直接察和判断 。-可以用于基因克隆，目的
基因检测等。
发展：Taq DNA聚合酶：分离于温泉菌中，耐高温。 PCR和TaqDNA聚合酶被美国《科学》杂志1989年的 “年度分子”，并被列为80年代10项重大科学发明之 首
基本原理：
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退 火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条 新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延 伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链 又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
8.1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将 沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶解。 9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃ 水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
10.琼脂糖电泳检测。检测，定量。
其它注意事项：
1。质粒质量： 首先实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提
质粒DNA的提取和 PCR技术
质粒提取
❖基本原理 ❖操作步骤 ❖注意事项 ❖实验室安全
基本原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至 200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独 立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒已 成为目前最常用的基因克隆的载体分子，碱裂解法是 最常用的方法。
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性
高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
基因组DNA会慢慢断裂 。混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试 剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基 因组DNA 。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀， 见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此时质
粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，