HSCCC中溶质可以进入并接触到液态固定相的整个体 积；HPLC中，溶质不能进入到固体支撑体内部，仅 涂渍在表面的有机层的液-固界面 HPLC有过载现象；
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
具有一定浓度梯度的沉淀剂通过半透膜引入柱中， 沉淀的样品分子通过离心力保留在柱中。
克服了传统色谱中由固体支撑体引起的样品损失及 柱子堵塞等问题。
高速逆流色谱法
高速逆流色谱概述 基本原理 技术特点 工作方法 仪器结构 方法应用
一、概述
逆流色谱（countercurrent chromatography, CCC） 是一种简单的液-液分配色谱技术，不用固体支撑体 来保留固定相，避免了样品的不可逆吸附、失活和变 性等问题，近年来逐步发展成为一种备受关注的新型 色谱分离技术。
梯度洗脱 （1）三元的溶剂体系
选择溶剂1和溶剂2为两种互溶溶剂（梯度溶剂）， 溶剂3不与前面任何一种互溶。
庚烷-甲醇-水体系：庚烷（固定相）水相（流动相） 乙酸乙酯-正丁醇-水体系：水（固定相）乙酸乙酯（流动相）
用于糖苷混合物的分离 糖苷溶解度：正丁醇 > 水 > 乙酸乙酯
（2）多元溶剂体系：情况复杂
HPLC
液体
固体
液-液分配（简单） 分配、吸附、离子交换、 体积排阻等（复杂）
与液体固定相的整个体 在固定相与固体支撑体
积相接触
的界面相互作用
高
中等
低
高
容易
复杂
便宜
昂贵
高速运转产生机械故障
安全
HSCCC与HPLC是互补的分离技术
四、工作方法
HSCCC的分离效果与以下因素有关： 1. 所选择的溶剂体系 2. 固定相和流动相的选择 3. 洗脱方式 4. 仪器的转向和转速 5. 样品浓度 6. 进样方式 7. 柱温等
3、样品溶液的准备和进样
通常将样品混合物溶解在分离所用的溶剂体系中
样品量较小时：可将样品溶解流动相中
样品量较大时：建议将样品溶解在相同体积的上相 和下相溶剂的混合液中。（物理性质发生变化，样 品进入分离柱后，会导致固定相的严重流失）
不能进太高浓度的样品 的优势
1. 独特的高制备能力、低廉的液态固定相和低溶剂消耗；
2. 不需要采用化学手段将手性试剂键合到固体介质上，只 需将其添加到液态固定相中即可；
正庚（己）烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系 上相：正庚（己）烷-乙酸乙酯有机相 下相：水-甲醇 甲醇变化 上相溶解在水相中
梯度溶剂一般总是使固定相体积减少。
（3）线性梯度和步进梯度
双向洗脱
样品组分覆盖极性范围宽，采 用等比例或梯度洗脱都很难实 现一次性分离。
第一步：反向洗脱
极性的水相->流动相 非极性的有机相->固定相
20世纪70-80年代，高速逆流色谱(high-speed CCC, HSCCC)被研制。利用螺旋管的特殊同步行星式运动模 式，短时间内实现高效分离。
1993-1994年间，pH-区带精制逆流色谱技术发展起来， 成功用于有机酸和有机碱的分离。
1998年，Ito研究得到离心沉淀色谱，为生物大分子 以及细胞等生物物质分离开辟渠道。
5、检测
紫外-可见光检测器 1. 单波长、多波长UV-VIS 2. 制备型HPLC的检测器 （检测池：直形的垂直流通型的。因为分析型HPLC的U
形检测池容易使固定相液滴滞留在池中，引起检测 器噪声。）
避免措施：轻相流动相从检测池上端进入，向下流出； 重相流动相从检测池下端进入，向上流出。
蒸发光散射检测器
例：Pharma-tech的CCC-20分析型逆流色谱仪（柱体积43mL）
Ito制备型多层螺旋管分离仪（柱体积280mL） 沙棘黄酮的分离
分析型HSCCC上样量3mg，分离过程15min； 制备型HSCCC上样量100mg，分离过程2.5hr。
葛根异黄酮的分离
2. 分配系数的测定
在CCC中，由于溶质的分配系数可以从色谱图中计算而得，因此 可以作为一种新型的测定分配系数的方法。
离心力场的强度和方向 都可以变化；
倾析和混合交替出现， 两相液体在螺旋管柱中 总是处在接触状态，没 有死体积存在；
流体动力学CCC中压力小， 固定相保留值大。
高速逆流色谱法是建立在单向性流体动力平衡体系之上的 一种逆流色谱分离方法，它是在研究旋转管的流体动力平 衡时偶然发现的。
当螺旋管在高速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到 另一端。用某一相作移动相从一端向另一端洗脱时，另一 相在螺旋管里的保留值大约50%，但这一保留量会随着移 动相流速的增大而减小，使分离效率降低。
傅里叶红外光谱检测器
（HSCCC获得高的溶质-溶剂比的流出物，使流动相吸收红 外光谱的问题得到解决。）
薄层色谱检测器（样品喷雾装置）
质谱检测器
五、仪器结构
分析型 制备型
方法应用
分析型HSCCC的应用 1. 溶剂体系的快速筛选 利用分析型HSCCC体积小、速度快、溶剂消耗小的特点。
但使螺旋管的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速 达到临界范围时，两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中 一相全部占据首端的一段，称这一相为首端相，另一段全 部占据尾端的一段，称为尾端相。
高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征， 在高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相， 它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送 入尾相，它将穿过首端相而移向螺旋管的尾端。
围； 粗样可以直接上样而不会对柱子造成任何损害； 操作成本低，制备量大； 操作灵活，固定相和流动相之间可以互换作用； 柱子可用合适溶剂清洗后重复使用。
高速逆流色谱与高效液相色谱比较
HPLC和HSCCC的固定相体积不同 理论塔板数的工 作范围不同；
到目前为止，逆流色谱的最高分离效率低于5000理 论塔板数。
（15cm长C18柱，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，观察出峰位置）
薄层色谱法
生物活性物质分配比率法：只适用于生物活性成分
分析型HSCCC法：用来选择制备型分离时所用的溶剂体系
2、柱系统的准备
固定相注入螺旋管柱内 1. 重相为固定相：尾头 2. 轻相为固定相：头尾
仪器以选定转速转动 流动相以合适流速泵入柱内 检测器基线稳定时，柱系统准备就绪 进样分析
逆流色谱的发展
20世纪50年代，逆流分溶法（CCD）被广泛用于天然产物 的分离。有设备庞大复杂、溶剂消耗大、分离时间太长等 缺陷。
20世纪70年代，液滴逆流色谱（DCCC）利用重力场将固 定相保留在管形柱中，使流动相以液滴形式通过固定相。 缺陷是分离时间长，溶剂体系有限。
改进后的离心分配色谱和螺旋管式逆流色谱，利用离心力 场来实现固定相的保留，缩短了分离时间。
例：系列烷基苯在正庚烷-甲醇-水体系中的分配系数
3. 小量天然产物样品的分离
粗样或其它复杂样品可以直接进样而不需要预先处理，样品也不 会因为不可逆吸附而损失。
例：多酚类物质的分离。
这类物质在HPLC上容易与色谱柱上的固体填料之间产生相互作 用，而导致拖尾。在硅胶柱上易发生不可逆吸附。 HSCCC被认为是分离多酚类物质最有效的手段。
中等极性物质 极性物质
基本两相溶剂体系 正庚（己）烷-甲醇 正庚（己）烷-乙腈 正庚（己）烷-甲醇（或乙腈）-水 氯仿-水 乙酸乙酯-水 正丁醇-水
辅助溶剂 氯烷烃 氯烷烃
甲醇，正丙醇，异丙醇 正己烷，甲醇，正丁醇 甲醇，乙酸
几种常用的溶剂体系选择方法
分配系数测定法（K:0.5-2，用分析型HPLC确定） HPLC扫描法
HSCCC相对于其他色谱技术具有许多独特有点。
应用领域与拓展
双水相逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用 离心沉淀色谱在蛋白质等分离中的应用 逆流色谱在手性分离中的应用 逆流色谱在天然药物工业中的应用
双水相逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用
双水相体系（aqueous two-phase system, ATPS）
分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相(固定相)， 然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋 管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多， 分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速 逆流色谱。