痰涂片标准化操作
普仁医疗集团 无锡市第五人民医院检验科 刘君
主要内容
标本收集与运送
抗酸菌涂片 Ziehl-Neelsen 染色 显微镜读片检查 结果登记与玻片保存 抗酸菌涂片检查假阳性及假阴性的可能因素
标本收集与运送
提纲
标本容器 标本编号 收集方法与运送注意事项 标本的质量评价
假阴性的原因
1）观察涂片的视野数量不足 2）镜检技术能力差 3）染色操作不规范（抗酸杆菌颜色 暗淡、背景太淡或过深） 4）显微镜存在问题 5）染液质量差
假阴性导致的结果
结核病人没有得到正确诊断和治疗， 向其他人传播疾病，或者死亡 随访病人缩短了应有的治疗时间
AFB假阴性结果的预防措施
确认标本是痰、而非唾液。 确认每份标本至少有1 ml。 选择脓样、干酪样、粘液痰涂抹制备玻片。 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。 使用高质量染料、按照配方配制染液。
次日清晨留取的痰
*如果规划指南有所调整，请依据指南调整
用于疗效监测的随访标本
随访标本 (在治疗期间和结束的时候收 集)
晨痰 另外一份标本依据 NTP 指南进行收
集
标本收集
安全意识: 患者比标本有危险!
如果有实验员指导监督病人留痰，那么 他面临的危险要远高于其他实验员
痰标本收集的生物安全
2. 痰标本来源：根据患者做痰检查时的情况，选 择1栏填写。初诊患者填写门诊序号，随访患者填 写患者登记号。
3. 性状：标本性状按照国家实验室质量控制新标 准，分为干酪痰（A）、血痰(B)、粘液痰(C)和唾 液(D)，分别按A、B、C、D分类登记。
填写说明：
4. 结果：涂片阳性者使用红笔记录为“数字+”， 如“1+、2+、3+”，300个视野内仅见1～8条抗酸 杆菌者填写“条数”；阴性结果填为“阴性”， 不能记录为“-”或“（-）”。
盒； 运送痰盒的注意事项
有关标本的信息
留痰或开化验单日期 病人姓名，性别，年龄，住址 痰盒上必须有病人的有关信息，不 能标在痰盒的盖子上 诊断机构名称（如果标本是外单位 送检的话）
专业机构的痰标本运送
耐药监测 乡镇的集痰点 结防所以外的机构送检标本
标本接收
核对化验单 检查标本的质量 体积 (3-5 ml) 描述标本的性状(干酪,血痰，粘液，唾
在玻片架上自然干燥
显微镜读片检查
显 微 镜 简 图
操作步骤
显微镜检查操作
涂片检查视野顺序
涂片镜检报告标准
3cm = 150 fields
2cm = 100 fields
2cm,
1 cm
3cm 2cm
2cm
1 cm
2 vertical lines, 1 cm each = 100 fields
单一的抗酸菌
“V”- 字形
成簇的抗酸菌
复染太浓造成的影响
适宜的复染
显微镜读片练习
76
报告结果分级
阴性
未发现抗酸菌/ 300 视野
报告实际菌落数 1-8 条 /300 视野
(1+)
3-9 条 / 100 视野
(2+)
1-9 条பைடு நூலகம்/ l 0 视野
(3+)
1-9 条 / 每视野
就诊者不要在实验室内留痰。 在室外留痰，最好在阳光直射的地方。 如果不能室外留痰，那么应在通风良好的室内
且远离他人。 就诊者留痰时，监督病人留痰的人员应站在留
痰者身后或身边，而不是站在留痰者的正面。
收集标本操作指南
就诊者注意事项： 如何减少对他人传染的危险
在空气流动的地点收集标本
持5分钟 流水轻缓冲洗 滴加脱色液，保持1分钟 流水轻缓冲洗 滴加亚甲兰复染液，保持1分钟 流水轻缓冲洗
将涂片排放在染色架上，注意间隔
火焰固定？？？
滴加碱性复红
加热
滴加染液和加热
滴加染液和加热
流水冲洗
不可大水流快速冲洗
脱色
流水轻缓冲洗后，复染
流水洗去复染液
液） 登记标本性状和进行实验室编号
只有获得高质量的痰标本 才能得到准确可信的抗酸菌镜 检结果
检验单参考样式
检验单内容
病人的一般信息：姓名、年龄、性别 初诊病人还是随访病人的痰标本 送检日期 镜检的报告结果 检测者及审核者 报告日期
抗酸菌涂片
要点
涂片的过程 涂抹一张符合要求的涂片进行示范 列出符合要求涂片的关键点 评价已经染色的涂片
不均匀 太厚 形状不规则，太薄
涂片质量的评价
形状不规范，太薄
好的涂片:
挑取了痰标本的脓性部分 做螺旋状轨迹涂抹均匀 大小约为 2cm X 1cm 不要太厚：透过染色前的痰膜可以隐
约看到报纸上的字
哪个涂片比较好？
Ziehl-Neelsen 染色
染色步骤
初染 (碱性复红) 脱色 (盐酸酒精) 复染 (亚甲兰)
登记本记录有何问题？
玻片的保存
如果使用显微镜附带的镜油，或者 是购买的粘度合适镜油（immersion oil）,而不是香柏油（cedar oil）,则 不需使用二甲苯，直接使用镜头纸 擦拭即可。
玻片的保存
干燥后的玻片，按实验室序号及涂片 编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干 燥环境中。处于潮湿炎热的环境中抗 酸菌易于褪色（见下图）
流动的空气能稀释气溶胶 UV 光线能将结核菌灭活 雾化消毒
标本收集
向患者解释清楚以下几点: 为什么需要痰标本； 需要几份痰，检查三次痰的必要性 晨痰的重要性，第二次送痰的必要性
向患者宣教:怎样留痰
唾液或鼻腔分泌物不是合格痰标本 合格的痰标本来自肺深部 什么是合格的痰标本，如何咳痰，如何使用痰
内容
涂片制备 涂片的关键 评价涂片
涂片制备
每一张玻片都要编号 涂抹痰标本 自然干燥 加热固定
使用铅笔在磨砂面上编号
使用竹木签进行涂抹
不得使用火焰加热的方法加速痰膜干燥
痰膜的厚薄
太厚
适宜
太薄
适宜的痰膜厚度
好 脱落
好 不均匀
涂片厚度
适宜 太厚 太薄
涂片质量的评价
(4+)
达到或超过 10 条 /每视野
涂片分级: 2 +
(1-9 条 /10视野至少 50 个视野)
涂片分级: 1 +
3 - 9 条 /100 视野
涂片分级:实际菌数
( 1－8 AFB in 300 fields)
将以下结果分级:
1＋
2+
3+
4+
1＋
3+
2+
抗酸染色原理
初染时碱性复红与细胞壁的分枝菌酸结 合
脱色时脱色液不能将碱性复红从抗酸菌 细胞壁上洗脱
抗酸菌的染色保持初染的颜色 复染提供背景对比
Z－N 染色的原理
抗酸菌
非抗酸菌
细胞壁脂质复合物
Z－N 染色原理
抗酸菌
非抗酸菌
碱性复红
脱色
复染
染色过程
将涂片排放在染色架上 滴加碱性复红染色液，加热出现蒸汽后，保
AFB痰检假阳性结果的预防措施
使用新的载玻片进行相应检查。 每个标本均使用新竹签完成涂抹。 所有染液均经过滤。 染色时玻片彼此保持一定距离。 严禁使用染色缸染色。 染色时勿使玻片上的染液干燥
AFB痰检假阳性结果的预防措施
滴镜油时，镜油容器或吸管不接触痰膜。 不要用竹木签蘸镜油 避免物镜镜头直接接触玻片痰膜。 完整、准确的标注痰盒、玻片和登记实验登记本。 登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核 对。准确记录和报告结果
乡镇查痰点的涂片送区县结防所 区县结防所涂片保存3个月
抗酸菌涂片检查 假阳性及假阴性的可能因素
假阳性的原因
1. 染料沉渣或结晶等 2. 脱色不彻底 3. 抗酸性物质或细菌 4. 染色液中污染抗酸菌 5. 实验室污染
脱色不彻底
假阳性导致的结果
就诊者被误诊误治 随访病人延长了治疗时间 浪费了医疗资源
痰容器规格
容积20-50ml 广口 半透明或透明的材质 一次性使用 螺旋盖且能密封防水防渗出 侧面容易标记（外壁有部分粗糙面）
哪种痰盒适宜?
哪种痰盒适宜?
哪一种容器可作为痰盒？
标本收集
收集3份标本，是发现传染性结核病 人的最优选择
收集标本时要同时为患者和实验员 提供方便。
AFB假阴性结果的预防措施
按照操作程序完成染色过程。 判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要
求的视野数。 采用已知结果为阳性的玻片作为对照，完
成染色镜检过程。
收集三份痰的优缺点
超过三份痰后，检出的可能性不能大幅 度提高
晨痰的检出率比即时痰高 收集三份晨痰对住院患者比较适合
前后两次检查在工作量较大时能发挥较 大的效率
如果NTP指南中对收集痰标本另有要求， 可以进行调整
标本收集
即时痰-夜痰-晨痰
即时痰 夜痰 晨痰
就诊时 夜间留取的痰
4+
登记与玻片保存
内容提纲：
实验室化验单的填写 实验室登记本的填写 我国NTP推荐的抗酸杆菌萋-尼氏法
镜检结果报告标准 报告假阴性、假阳性结果造成的后
果
化验单参考样式
实验室登记本
填写说明：
1. 实验序号：为实验室流水号，每年从“1”开始， 初诊患者的3个标本，随访患者2个痰标本，每次 均用同一实验序号编号。
5. 报告人：检验人员填写全名。 6. 备注：填写需要特别说明的事宜。