叶绿素含量的测定
一.实验原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL.式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
就是吸光度的加和性。
如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
植物叶绿素含量测定----丙酮提取法
高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。
叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。
叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。
在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。
叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。
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叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。
叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。
●利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。
其数学表达式为：
●A=Kbc 式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。
●叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。
叶绿素a 和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。
根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示：
●A663=82.04C a+9.27C b （1）
●A645=16.76C a+45.60C b（2）
●C a=12.7 A663—2.59 A645(3)
●C b=22.9 A645—4.67 A663 (4)
●C a十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5)
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从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm
和645nm 处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度和叶绿素总浓度（a+b ）。
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●所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算：
●叶绿素含量（mg·g -1或mg·dm -2）= C ×V
● A ×1000 ● 式中：C 为叶绿素浓度（mg·L-1）或mg·dm-2）；V 为提取液总体积（ml ）；A 为
取样鲜重（g ）或取样面积（dm-2）。
80%丙酮提取液中色素浓度计算公式: (浓度单位：mg/L ）
C a = 12.21A 663 – 2.81A 646
C b = 20.13A 646 – 5.03A 663
C T = C a + C b = 17.32A 646 – 7.18A 663
C x.c =(1000A 470 –3.27 C a – 104 C b )/229
●植物组织中单位鲜重各色素的含量(mg.g/L)
●叶绿体色素的含量=
● 色素的浓度(mg.L -1) ×提取液体积(L) ×稀释倍数
● 样品鲜重(或干重,面积,g 或m 2)
二. 试剂与材料
2.1 试剂：
丙酮、石英砂、碳酸钙
2.2材料：
菠菜的新鲜叶片。
2.3 仪器与器皿：
分光光度计、台秤、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管
三. 实验步骤
叶片洗净、吸干、去大叶脉
↓
称0.5g 叶用丙酮研磨
↓
匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）
↓
滤液用80%丙酮定容至10mL
↓
适当稀释后测A 645、A 663
四. 结果计算
4.1 结果计算
C(mg/L)×提取液总量（L ）×稀释倍数
Chl =
(mg/g叶) 材料鲜重（g）
4.2 比较分析不同植物的叶绿素含量差异及同种植物在不同生长环境下Chla/Chlb差异。
五. 注意事项
●注意叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差
●叶绿素初提液体积不要太多，以免浪费试剂，如果浓度太高可进行适当稀释
●注意分光光度计的规范使用
六. 思考题
●为什么植物在不同生长环境下其Chl含量有差异？Chla /Chlb有何适应意义？。