代谢相关疾病基因功能研究介绍代谢是生物体内所发生的用于维持生命的一系列有序的化学反应的总称。

常见的代谢性疾病有糖尿病、肥胖症、骨质疏松、痛风、脂质代谢紊乱以及甲状腺、垂体、肾上腺、性腺、甲状旁腺等疾病。

一、疾病模型(一)糖尿病模型。

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。

高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。

在对糖尿病的研究中，常见的模型包括：1.一型糖尿病模型A药剂诱导型：①STZ (streptozocin), 链脲菌；②Alloxan,四氧嘧啶B自发型：①NOD (non-obese diabetes)小鼠；②AKITA小鼠2.二型糖尿病模型A肥胖二型糖尿病模型①db/db小鼠②ob/ob 小鼠③Zucker fatty大鼠④ZDF (Zucker diabetic fatty) 大鼠⑤果糖（fructose）长期饮食的二型糖尿病动物模型⑥果糖短期饮食+低剂量STZ一次投药B瘦型二型糖尿病模型GK(Goto-Kakizaki )大鼠(二)肥胖症模型。

肥胖症是一组常见的，古老的代谢症群。

当人体进食热量多于消耗热量时，多余热量以脂肪形式储存于体内，其量超过正常生理需要量，且达一定值时遂演变为肥胖症。

在对肥胖的研究中，常见的模型有：1.谷氨酸钠(MSG)诱导的肥胖动物模型新生小鼠或大鼠皮下注射MSG可诱导其产生肥胖。

脂肪堆积是MSG肥胖动物的主要表现,其体脂在2周龄时即显著增加,一直增加到4月龄时。

在30～90d时即已形成脂肪肝。

2.金硫葡萄糖(GTG)致肥胖模型给成年小鼠腹腔注射GTG可诱导其产生肥胖, GTG所诱导的肥胖,被人们普遍认为系下丘脑“饱中枢”受损所致,因用GTG后,可观察到小鼠的VMH的苍白球部的细胞、神经纤维网和血管遭受破坏。

用电烧灼以破坏该部位同样可引起多食和肥胖。

3.食物诱导的肥胖动物模型高脂食物、高糖食物均可引起肥胖,另外可口的食物如糖果、可可、乳酪、意大利腊肠及加糖的浓牛奶等均可诱导肥胖;除此之外,过度摄入食物亦可导致肥胖。

(三)高血脂模型1、LDLR-/-小鼠模型：低密度脂蛋白受体缺陷型小鼠模型小鼠有以下特点：(1) 胰岛素抵抗容易被诱导，有利于药物或保健食品对胰岛素抵抗作用的筛选和效果观察；(2) 在高脂模型饲料喂养后很快发生血浆胰岛素水平升高、血糖升高(糖尿病)，因此，LDLR-/-小鼠是胰岛素抵抗向II型糖尿病发展的理想模型；(3) LDLR-/-小鼠的血脂和胆固醇分别非常接近人类（见“不同动物之间以及与人类血脂和脂蛋白代谢与转运的比较”），在该小鼠中研究胰岛素抵抗与血脂改变的关系，比在大鼠和普通小鼠中研究有独特的优势。

(4) 高脂模型饲料喂养后LDLR-/-小鼠容易发生肥胖、非酒精性脂肪肝和动脉粥样硬化，在该小鼠中研究胰岛素抵抗有利于分析胰岛素抵抗与这些疾病的关系。

该模型小鼠在喂养高脂模型饲料后的几周内发生胰岛素抵抗、高胰岛素血症，并且很快发生高血糖。

根据研究报道，胰岛素抵抗发生后持久维持。

但相继发生脂肪肝和动脉粥样硬化，因此，应当根据你的研究具体情况确定最合适的造模时间。

2、ApoE-/-小鼠/大鼠模型：高脂高胆固醇模型饲料进行的ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化造模中，脂肪和胆固醇都在对动脉粥样硬化形成和发展中起作用。

其中，脂肪引起代谢综合症表现（胰岛素抵抗、肥胖，等等），从而推动动脉粥样硬化的形成，而胆固醇本身也在起作用，胆固醇的作用取决于模型饲料中胆固醇的含量。

3、两者区别：APOE-/-为自发的动脉粥样硬化模型，与人的动脉粥样硬化进程更为相似。

而LDLR-/-在正常饮食情况，不会出现动脉粥样硬化斑块，需要高胆固醇饲料诱导。

(四)除此之外，由于肝脏是身体内以代谢功能为主的器官，并在身体里面有着去毒素，储存糖原(肝糖)等功能。

基于肝脏常见的模型还包括：1.肝损伤动物模型①化学性肝损伤模型。

②免疫性肝损伤模型。

③酒精性肝损伤模型。

2.病毒性肝炎模型①甲型肝炎病毒(HAV)动物模型采用的实验动物有黑猩猩、绒毛猴豚鼠、豚鼠。

②乙型肝炎病毒(HBV)动物模型采用的实验动物有美洲旱獭、黄鼠属啮齿动物等。

③丙型肝炎病毒(HCV)所采用的动物有黑猩猩、树鼠句、转基因小鼠。

④丁型肝炎病毒(HDV)所采用的动物有黑猩猩、美洲旱獭、树鼠句。

⑤戊型肝炎病毒(HEV)所采用的动物有非人灵长类动物和猪。

3.肝纤维化动物模型①中毒性肝纤维化动物模型。

②异种动物血清诱导肝纤维化动物模型。

③乙醇诱导肝纤维化动物模型。

④二甲基亚硝氨诱导肝纤维化大鼠模型。

4.肝移植动物模型大鼠肝脏移植有原位肝脏移植和异位肝脏移植。

大鼠原位肝脏移植所采用的方法有改良Sun法, 单套管法, 双套管法, 三套管法和吻合肝动脉的大鼠原位肝脏移植。

小鼠肝脏移植主要是小鼠原位肝脏移植。

二、研究的主要脏器和细胞肝脏是代谢研究中最重要的脏器。

因此，代谢研究的主要对象包括肝脏、原代肝细胞、来源于肝脏的细胞系（HepG2、Huh7等）等。

除此之外，跟代谢密切相关的脏器或者组织还包括胰腺、肌肉、脂肪、小肠等；有时候巨噬细胞、内皮细胞等也属于代谢的研究范围。

三、病毒选择目前主流的三大病毒载体：慢病毒、腺病毒、AA V（腺相关病毒）。

慢病毒腺病毒腺相关病毒特点与应用感染表达范围广泛，适合细胞系建立稳转系，比如HepG2、Huh7、3T3-L1等感染能力强，特别适合于原代细胞基因转导，如肝原代细胞等，效果极其出色某些特殊情况下可用来感染肝脏安全性及高；免疫原性低，长效表达（稳定表达3-6个月）；病毒颗粒小，感染均一性高；尾静脉注射特别适合肝脏基因转导；脂肪和肌肉可以选择局部注射，或者结合组织特异性启动子选择尾静脉注射应用局限对肝脏、肌肉、脂肪组织的感染能力有限，一般不推荐使用队医在体感染来说，免疫原性高，可能引发强烈的免疫反应；病毒颗粒直径大，容易被清除，表达周期短，大约2周时间；较少被应用于除肝脏之外的其他组织的基因转导表达到高峰所需的时间长、载体容量小。

对于某些非常大的基因（如CDS大于5kb）通常只能求助于腺病毒载体表 1 三种病毒的应用比较。

如果是在体研究代谢，腺相关病毒（AAV）有着得天独厚的优势：AAV颗粒直径小，滴度高，在胰腺、肠道、肌肉等组织中扩散均匀，极低的免疫原性，安全性好，可稳定表达6个月以上，AAV-8感染胰腺效果较好，AAV-1/2/5感染肠道效果较好，AAV-1/9可用于对肌肉的感染，以上都体现了AAV在糖尿病研究中的优势，其作为最有前途的基因治疗利器，也是高分文章必备！！而腺病毒在动物上表达效率低，有着高免疫原性，容易诱发免疫反应。

慢病毒滴度低，效率低，在体水平表达较差。

四、注射方式1.肌肉注射（图1）：一般选取鼠前后肢部位注射，注射时针头要垂直快速刺入肌肉，如无回血现象即可注射。

图1. 小鼠腓肠肌原位注射。

左图是小动物活体成像，右图是冰冻切片荧光图。

2.尾静脉注射（图2）：即从动物尾部的静脉注射病毒，依靠血液循环到达目的组织器官，操作简方便，是目前使用最广的注射方式。

图2. 小鼠尾静脉注射示意图和效果实例。

3.胰腺导管注射（图3）：可以实现对小鼠胰腺的局部感染，过程中需要对小鼠进行固定，手术，步骤繁多，操作起来略显麻烦。

图3. 胰腺导管注射图，采用AAV-8，胰腺导管注射150 μl。

4.肠系膜静脉注射：门静脉注射需要开腹寻找门静脉，腹腔会蒸发过多的水分，给实验动物造成额外的损伤，而肠系膜静脉注射手术切口小，静脉易寻找，手术时间短。

5、腹腔注射：对于胰腺的感染，某些AAV的特殊血清型非常适合腹腔注射。

6.腹内脂肪—腹腔注射（图4）：用小鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。

图4. 腹腔注射图，采用AAV-9，大鼠腹腔注射300 μl，小鼠腹腔注射150~200 μl。

3.皮下脂肪-原位注射（图5）：注射时，局部剪毛，可在注射局部用消毒棉球将被毛向四周分开，用70％酒精棉球消毒后，以左手的拇指、食指和中指将皮肤轻轻捏起，形成一个皱褶，右手将注射器针头刺入皱褶处皮下，深约1.5～2 cm，药液注完后，用酒精棉球按住进针部皮肤，拔出针头，轻轻按压进针部皮肤即成。

图5. 皮下脂肪-原位注射和脂肪组织感染图，采用AAV-9，大鼠和小鼠原位注射10-15 μl /点，约3-5个点。

需要强调的是，对于肝脏AV8是公认的高效特异性靶向肝脏表达的病毒载体血清型。

AAV9比AAV8特异性稍差一些，但是感染效果较AAV8强（图2）。

AAV9还可以在肌肉、中枢神经、肺等组织中表达。

基于此，汉恒生物提供肝脏特异性AAV，通过AAV9，优选肝脏特异性启动子和其他分子元件，实现肝脏的高效基因转导：①高感染表达率：汉恒强启动子载体AAV9，通过静脉注射，高效感染肝脏，特异性上略差。

②高肝脏特异性AAV：汉恒对一些肝脏启动子不同片段进行不同长短体的严筛，确定TBG特异性启动子，高特异地表达于肝脏（图6）。

肝脏中起始TBG正常转录的元件较多，因此在肝脏中相对表达量较其他部位高出很多。

图6. 肝脏特异性AAV(AAV9-pTBG-Luc)体内感染效果图，尾静脉注射100 μl，感染3周，小动物活体成像。

数据来源：汉恒实验室自验证。