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1、固定化酶在工业生产上的应用
氨基酰化酶； 葡萄糖异构酶； 天冬氨酸酶； 青霉素酰化酶； 延胡索酸酶； β-半乳糖苷酶； 天冬氨酸-β-脱羧酶
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DL-氨基酸的光学拆分
Aminoacylase
氨基酰化酶
乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸
乙酰 -D — Ala
这是世界上固定化酶在工业生产上应 用的第一个实例。
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A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
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固定化酶 柱子
泵 反应产物
消
离心机
旋
反
应
器
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
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（2）酶传感器（酶电极）
酶传感器
微生物传感器
Hale Waihona Puke 生物传感器• 吸附法特别适合于动物细胞的固定化。
• 常用的吸附固定化载体的方法有转瓶、 微载体和中空纤维。
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二、包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体 中，使酶固定化的方法。
根据载体材料和方法的不同，分为凝 胶包埋法和半透膜包埋法。
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1、凝胶包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微 孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化 含酶菌体。应用最广 。
化的。此外，DEAE-纤维素吸附的α-淀
粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。
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离子吸附法所使用的载体是某些离子交换
剂。常用的阴离子交换剂有DEAE-纤维素、
混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙
基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、
Amberlite IRA-93、410、900等；阳离子
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固定化酶
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
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固定化菌体：固定在载体上的菌体或菌 体碎片。 固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用 为目的。
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酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶
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四、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作
用，制成网状结构的固定化酶的方法。
双功能试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二
酸酐、双偶氮苯等。
戊二醛[OHC-(CH2)3-CHO]
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五、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理 一段时间，使酶固定在菌体内，而 制备得到固定化菌体。 只适用于那些热稳定性较好的酶的 固定化。
第七章 酶固定化
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酶的一些不足之处
（1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难
固定化技术的应用改善酶的不足。
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• 早在1916年，美国科学家奈尔森和格 里芬就发现，酶和载体结合以后，在 水中呈不溶解状态时，仍然具有生物 催化活性。
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•物理吸附法制备固定化酶，操作简单、价廉、 条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后， 活性部位及空间构象变化不大，故所制得的固 定化酶活力较高。但由于靠物理吸附作用，酶 和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落， 所以使用受到限制。常与交联法结合使用。
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吸附法
• 吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶分子表面间的 次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简 单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互 作用、离子键和氢键等。
• 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
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物理吸附法
• 1971年，第一次国际酶工程学术会议 在美国召开，会议的主题就是固定化 酶的研制和应用。
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固定化酶（Immobilized Enzyme）： 固定在载体上并在一定的空间范围内进 行催化反应的酶。
采用各种方法，将酶与水不溶性的载体 结合，制备固定化酶的过程。
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特点：活力损失少，结合力弱，应用时要 严格控制好pH、温度、离子强度。
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（2）共价键结合法
以共价键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、 甲壳质、氨基酸共聚物等。
使载体与酶形成共价键，必须首先使载
体活化。
重氮法
载体活化方法
迭氮法 溴化氰法
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①对热稳定性提高 ②保存稳定性好 ③对蛋白酶的抵抗性增强 ④对变性剂的耐受性提高
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2、最适温度： 一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。
3、最适pH值： 往往会发生一些变化。 影响因素主要有两个，一个是载体的带电 性质，另一个是酶催化反应产物的性质。
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离子吸附法(ion adsorption)是将酶与含 有离子交换基团的水不溶性载体以静电 作用力相结合的固定化方法，即通过离 子键使酶与载体相结合的固定化方法。 此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、
β-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途
较广。如最早应用于工业化生产的氨基 酰化酶，就是使用多糖类阴离子交换剂 二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖凝胶固定
烷化法
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酶蛋白分子上可供结合的功能基团有
（1）酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基 的ε-氨基。 （2）酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸 残基的β-羧基以及谷氨酸残基的γ-羧基。 （3）半胱氨酸残基的巯基。 （4）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。 （5）组氨酸残基的咪唑基。 （6）色氨酸残基的吲哚基。 （7）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。
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• 在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。
–（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中 心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质 分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损 害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下 发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又 要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。
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–（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的 固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化 酶能有效回收贮藏，利于反复使用。
–（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强 度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。
–（4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化 应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化 效率和产物的量。
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几种酶固定化方法各有所长，如几种方 法合用，往往效果更好。
采用固定化方法要考虑的因素： ①固定化酶的稳定性； ②酶、载体及试剂的费用、操作难易等 与工业化有关的因素； ③安全性。
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二、固定化酶的特性
1、稳定性： 一般比游离酶的稳定性好。
ß－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O
半透膜 葡萄糖氧化酶胶层
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固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多 次地使用；
（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制 生产过程，同时也省去了热处理使酶失活 的步骤；
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（3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。
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细胞传感器
组织传感器
免疫传感器
是利用酶、抗体、微生物等作为敏感
材料，将所感受的生物信息转换成电信号
进行检测的传感器。
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酶传感器：
是由固定化酶与电化学电极构成。 常用的电化学装置：
O2电极、pH电极、CO2电极、NH3电极 等。
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酶传感器的分类
电流型酶传感器：是从与催化反应有关物
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4、底物特异性： 其变化与底物分子量的大小有一定关系。 对于那些作用于小分子底物的酶，固定 化前后的底物特异性没有明显变化。 原因：载体的空间位阻作用
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三、固定化酶的应用
固定化酶的优点：
①酶的稳定性增加； ②可反复和连续使用； ③易于和反应产物分开。
间歇
吸附
包埋
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间歇
固定化
交联
化学偶联
连续
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第一节 酶的固定化方法
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• 固定化酶的制备方法、制备材料多种多样， 不同的制备方法和材料，固定化后酶的特 性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自 身的性质、应用目的、应用环境来选择固 定化载体和方法。
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交换剂有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠
檬酸盐、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-
200、Dowex-50等。其吸附容量一般大
于物理吸附剂。
离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶
活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同