determining the exact sequence of bases that make up a gene.
Gilbert and Sanger share the 1980 Nobel Prize).
测序方法
• 化学裂解法 Maxam-Gilbert (chemical) sequencing
基因测序的原理及应用
大纲
一、第一代测序技术的原理、发展和应用 三、下一代测序技术的诞生、发展和应用 三、第三代测序技术与展望
DNA发现与测序技术的发展主要时间表
第一代测序技术的诞生、发展和应用
一、第一代DNA测序原理 DNA sequencing
Walter Gilbert
Frederick Sanger
物
寻找SNP连锁位点
1、单基因病位点PCRNGS + Sanger
2、染色体筛查 (PGS)
3、连锁分析验证
无创胚胎染色体筛查（NICS）
• 近日，全球首例接受无创胚胎染色体筛查 （NICS）的试管婴儿于无锡诞生（201603012）。
• 末端终止法 Sanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing
• DNA序列测定技术，是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳技术的基础上建立起来的。变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳能够分离长度达到300～500个碱基，而差 别仅1个碱基的单链寡聚核苷酸。
• 技术由三部分组成 1 产生不同长度的DNA片段,差别仅1个碱基。 2 在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。 3 测序胶的放射性自显影技术。
杜氏肌营养不良 DMD
多囊肾PKD1
肝豆状核变性病 ATP7B
脊肌萎缩症SMA 软骨发育不全FGFR3 血小板增多JAK2
腓骨肌萎缩CMT1A
表皮角质化过度 KRT1
先天性免疫缺陷 IL2RG
黏多醣症IDS
寻常型鱼鳞病FLG
单基因遗传病PGD方案策略
1、抽父母及患儿 血验证
方 案 策 略
2、囊胚活检 MALBAC扩增产
而直接“读出”碱基顺序。
从平板到毛细管！
测序过程
1. 模板DNA制备 2. 测序反应 3. 测序反应后的纯化 4. 变性、毛细管电泳和检测 5. 数据分析
模板DNA的制备
1.用质粒抽提或胶纯化试剂盒得到的质粒或PCR产物模板 2. 将DNA模板储存在灭菌水里如ddH2O, 超纯水；注意不 要含有EDTA等抑制测序反应的物质 3. 通过紫外分光光度计测定模板浓度（〉0.1ug/ul)及 质量(OD260/OD280在1.6-1.8之间）
常见遗传病基因诊断板
PGD
体外授精胚胎植入前遗传学诊断（IVF-PGD）
常见单基因病PGD
遗传性耳聋
呼吸肌萎缩MTM1
多发内分泌系统腺瘤 RET
地中海贫血 肥厚型心肌病TNNT2 噬血细胞综合症PRF1
[ -35s]-dATP
ddNTP
ddCTP
H
Dideoxy Sequencing of DNA
dNTP
ddNTP
proceeding for DNA synthesis:
ddATP
H
1.手工测序（同位素）
– 读序长度: 约 300bp – 同位素32P, 35S标记 – 结果通过人工肉眼分析
• 1975 DNA sequencing developed: Walter Gilbert and Allan
Maxam of Harvard University and Fred Sanger of Cambridge
University simultaneously come up with two techniques for
末端终止法原理
• 使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基 特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差 一个核苷酸的单链DAN等3种方法。当反应遇到双脱氧的 核糖核苷酸底物（ddNTP）时，掺入到新生的DNA链中， 但是该双脱氧的核糖核苷酸的掺入阻止了DNA链进一步 的延伸反应，形成了长短不同的DNA片段。通过电泳和 放射自显影读出DNA序列。
测序反应
DNA测序仪检测
DNA测序仪检测
测序结果常用打 开软件： Chromas
测序结果一般包括两 个文件： 1）.abi 文件，即测 序峰图文件
2）.seq文件，即由 峰图文件导出的序列 文件
序列有缺失 杂合子
重复序列
下一代测序技术的诞生、发展和应用
下二代测序（NGS）
dNTP (dATP, dGTP, dCTP & TTP)
dATP
PPi (pyrophosphate) or diphosphate
3’-5’phosphodiester bond
DNA sequencing
dCTP
DNA polymerase,
Substrate
dNTP,
H
[ -32p]-dNTP,or
DNA复制过程
DNA聚合酶（DNA polymerase）是DNA复制 DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA为复 制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的 酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成 （在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及 其相辅的活性。
DNA 合成的底物
deoxynucleoside 5’-triphosphates
2.DNA序列的自动测序
2.1基本原理
2.2 其独特性在于：
➢ 带4种不同荧光染料的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP) 作为链终止剂，而替代了手工测序的同位素标记。
➢ 采用聚丙烯酰胺区分长度仅差1个碱基的单链DNA。 ➢ 一个样品的4个测序可以在一个泳道内电泳，从而降低
了测序泳道间迁移率差异对精确性பைடு நூலகம்影响。 ➢ 电泳之后，就可以通过全自动激光激发以及荧光检测
“下一代”测序又称高通量测序，能一次并行对几 十万到几百万条DNA分子进行序列测定。
• 主要有以下几种：罗氏P454焦磷酸测序、 Illumina (MiSeq， HiSeq)测序 、Life Tech（Ion torrent Proton）离子半导体测序、DNA 纳米球测 序等。
• 发展迅速，应用广泛：如何应用，要敢于想！想 到就能够做到！