第26卷 第3期2008年9月 贵 州 科 学GU I ZHOU S CI ENCE V o.l 26,N o .3Sept .2008收稿日期:2007-01-25基金项目:贵州省优秀科教人才省长基金,贵州省自然科学基金(基合字(1999)3105)作者简介:张难(1982-),女,重庆人,在读硕士研究生,主要从事多糖结构修饰研究.邱树毅,(1963-),男,教授,博士.通讯作者,E -m ai:l s yq i u @gz u .多糖的分子修饰研究进展张 难1,2,吴远根1,3,莫莉萍4,张永凤1,邱树毅1,3,王文平1,3(1.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州 贵阳 550003;2.贵州大学生命科学学院,贵州 贵阳 550025;3.贵州大学化学工程学院,贵州 贵阳 550003;4.贵阳市生产力促进中心,贵州 贵阳550002)摘 要 多糖是重要的药用活性成分,具有抗肿瘤、抗凝血和免疫调节活性等多种功能,而多糖的分子修饰能够提高它原有的活性或增加新的活性.本文详细阐述了多糖的硫酸化、磷酸化、乙酰化等分子修饰及其对生物活性的影响,最后对多糖的分子修饰及其应用进行了展望.关键词:多糖;分子修饰;生物活性中图分类号 O 629.12 文献标识码 A 文章编号 1003-6563(2008)03-0066-06PROGERSS I N MOLECULAR M ODIFICAT I ON OF POLYS AC -CHAR I DESZ H AN G N an 1,2,W U Yuan -Gen 1,3,M O L i -P ing 4,Z H AN G Y ong-F eng 1,Q IU Shu-Y i 1,3,W AN G W en -P ing 1,3(1.G u i zhou K ey L aborato ry of F er m en tati on Eng i neering and B i ophar m acy ,Gu i y ang 550003;2.Coll ege ofL ife Science ,G u i zhou U niversity ,G u i yang 550025;3.Schoo l of Chem ical Eng i neer i ng ,G uizhou U niversity ,G u i yang 550003;4.Gu i yang P roductivity P romo ti on Center ,G uiyang 550002)ABSTRACT Po lysacchar i des are t he i m portant med i c i ne i ng red i ent ,wh ich play si gn ifican t ro le i n anti-t umo r ,i m m un it y m odu l a tion and anticoagulation .T he struct ura l mod ificati on of po lysacchar i des can no t on l yenhance t he ir intrinsi c activ iti es ,but a lso i ncrease the undiscovered acti v iti es .In th i s paper ,t he m ethods ofstruct u ra lm odifica ti on such as sulfa ti on ,phosphory l a ti on and acy lati on i n po l ysaccharides and the ir i n fluence onb i o l og ical activ i ty are i n troduced ,and t hen t he structural m odificati on and app licati on o f po l ysaccharides areprospec ted .K EY WORDS po lysacchar i de ,mo lecu l a r mod ifi cation ,b i o log ica l ac tiv iti es多糖(po l y sacchari d es)在自然界蕴藏丰富,种类繁多,主要有植物多糖、动物多糖、海藻多糖和微生物多糖.多糖是一种重要的生物活性成分,具有重要的医疗价值,有抗肿瘤、抗凝血和免疫调节等多种的药理作用.随着糖生物学和糖化学的发展,多糖的生物活性越来越受到人们的重视,有关多糖生物活性的研究有了长足的进步和发展.海带多糖(Lam i n ria Jap onica po lysaccharides)是海带中提取的一种具有生物活性的海藻多糖,经初步鉴定海带多糖具有抗突变活性[1].壳聚糖(ch itosan)具有生物粘附性和多种生物活性,且能有效地增强亲水性药物在鼻腔和肠上皮的吸收,作为缓释辅料有着广阔的应用前景[2].据研究,团核褐孔菌(X an t h ochrous rheades )液的粗多糖对大鼠有抗胃溃疡活性[3].灵芝(Ganoder ma lucidum )胞外多糖有抗肿瘤活性,且能明显提高小鼠的免疫力[4].香菇多糖(Lentinan,LNT )是香菇(lentinus edodes )为适应外界环境,在生长过程中形成的一种具有独特生理活性的物质,其化学结构属于吡喃葡聚糖,现代药理学研究证明,香菇多糖具有抗肿瘤,抗凝血和免疫调节活性的重要药理作用,是优良的天然药用活性成分,具有重要的学术价值和广阔的应用前景,也成为了人们研究的重点之一[5].已完成的研究证实,多糖的活性直接或间接地受到其分子结构的影响.多糖的结构包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构.采取一定的方法对多糖分子结构进行适当修饰可以改变多糖的活性.目前对多糖进行修饰的常见方法有硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、磺酰化、羧甲基化等.此外,其它修饰方法,如酶法、超声波、酸降解等在多糖分子修饰中也有较好的运用[6,7].多糖经过分子修饰后,其生物活性有一定的提高[8],甚至还增加了新的功能,如天然香菇多糖具有抑制肿瘤的作用,而硫酸化后显示出较高的抗H I V 的活性[9].随着对多糖构效关系研究的不断深入,针对多糖的化学修饰也显得越来越重要,本文就近年来多糖分子修饰的方法和修饰后的生物活性的变化进行了简单综述.1 多糖的分子修饰多糖分子修饰的方法有很多,主要分为物理方法、化学方法和生物方法.除了对多糖主链进行修饰外,也可以对其支链进行修饰.根据修饰前后分子量的变化,可以把多糖修饰分成两大类,一类是对多糖分子进行接枝修饰,增加多糖的功能基团和分子量,提高其生物活性;另一类是对多糖进行降解修饰,降低多糖的分子量,提高其在水相中的溶解度,从而提高其活性.1.1 多糖分子的接枝修饰1.1.1 多糖分子的硫酸化修饰硫酸化修饰是多糖修饰中常见的方法之一,其修饰结果是将硫酸基团加到多糖的糖基上,修饰后的多糖称为硫酸多糖.一些天然多糖经过硫酸化修饰后得到了用途更为广泛的多糖衍生物.凝结多糖(cur d lan)是一种微生物多糖,它本身不具有生物学活性,经硫酸化修饰后的产物即硫酸化凝结多糖能有效抑制H I V -1在H 9细胞中的感染,与常规的抗H I V 药物相比,硫酸化凝结多糖具有抗H I V -1活性高、抗凝血副作用低的特点,是一种有应用前景的抗H I V 药物[10].高山红景天(R hod iola sachalinensis A.Bor)中含有多种有效成分,应用小鼠柯萨奇B5病毒模型,灌服硫酸化高山红景天多糖(RSP)后,感染病毒小鼠血液SOD 活性明显升高,LPO 含量下降,减少了自由基对机体细胞的损伤,使心肌及各脏器功能得到恢复和改善[11].茯苓(Po -ria cocos (S chw.)W o lf )为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核,其中含有茯苓聚糖(pachy m an).未经化学结构改造的茯苓聚糖生物活性低,对肿瘤抑制率仅0.13%,且不溶于水,难以对其进行深入的药理研究及其临床制剂应用研究.硫酸化修饰后的茯苓多糖能溶于水,并增强了机体的免疫功能,具备抗肿瘤、抗病毒等活性[12].香菇多糖经硫酸化修饰后,其抗肿瘤、抗凝血和免疫调节作用得到很大提高[13],而且具有了明显的抗艾滋病毒的效果[7],可抑制H I V -1产生的病变[14].例如,YCP 是从海洋中的一种细丝状的真菌(K eissleriella s p .YS4108.)中获得的多糖.Fang H an 等[15]以无水甲酰胺(FA )作为溶剂,用氯磺酸-吡啶复合物作硫酸化试剂,成功地对多糖YCP 进行了硫酸化修饰.实验结果表明,氯磺酸与YCP 的摩尔比率越高,取代度越高.当氯磺酸与YCP 的质量比为12B 1时,达到最大取代度1.3.对修饰后的YCP 进行活性分析,结果表明硫酸化YCP 可以明显提高抗凝血活性和抗血小板聚集活性.Christian W.K ¾sbaue 和Vog lH.等[16-17]以无水二甲基甲酰胺(D M F)作为溶剂,在惰性气体保护下,分别对B -(1y 4)-半乳寡糖(galacto -o li g osaccharides)和线性半乳聚糖(li n ear(1y 4)-B -D -galactan)进行SO 3-吡啶复合物的硫酸化分子修饰.结果显示,硫酸化后的B -(1y 4)-半乳寡糖的聚合度较低(甚至是67 3期 张 难,等:多糖的分子修饰研究进展68贵州科学26卷5碳糖),对增血压素具有很强的抑制作用[16],而Vog lH.发现增加反应的取代度能得到更好的效果[17].Jianhong Yang等[18]用上述同等条件,对Ch i n ese lacquer po l y sacchari d es(LPs)进行硫酸化分子修饰.结果表明硫酸化反应的最初阶段具备较高的反应效率,硫酸化多糖的结构对其活性影响很大.高取代度和高分子量的硫酸多糖具有较高的抗凝血活性,硫酸酯的数量对其活性有很大的影响,此外多糖支链的切除会降低硫酸化多糖的抗凝血活性,特别是末端的支链上接有4-O-甲基-B-葡萄糖醛酸的多糖对抗凝血起着重要的作用[8].从目前的研究来看,多糖硫酸化分子修饰后其空间构象和生物活性如何变化,还缺乏深入研究,继续开展对硫酸化方法的探讨,开发高效的硫酸化工艺将推动硫酸化多糖在药物领域中的发展.1.1.2多糖分子的磷酸化修饰与其它化学修饰一样,多糖的磷酸化分子修饰是一种共价修饰.多糖经过磷酸化分子修饰后,支链上的羟基被磷酸根取代,从而增强多糖抗肿瘤和抗凝血的生物活性[19].早期研究表明,大多数磷酸基团的共价键都是在支链上,而不是直链上[20].磷酸基团的单酯主要接在葡萄糖单元的碳-6位和碳-3位上,而碳-3的磷酸化对多糖生物活性的提高是非常显著的[21-24].对吡喃葡聚糖结构磷酸化修饰的常用磷酸化试剂有一磷酸钠、二磷酸钠和三聚磷酸钠.研究结果表明,在同等条件下,用三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的混合试剂进行修饰反应,磷酸根的取代度最大.随着磷酸化试剂用量的增加,取代度相应增加;反应温度升高,反应时间加长,磷酸根的含量也随之增加[25],这可能是因为能量升高,会使高分子键的活性增强,磷酸化试剂的利用率也会随之增加.另外,反应时间的长短也是一个重要因素,反应时间越长,吡喃葡聚糖结构物质的含磷量越高[26-28].在多糖的磷酸化分子修饰中,pH值的大小也显著地影响着磷酸化的程度.一般情况下,多糖分子的磷酸化修饰时,pH值应该控制在6.在磷酸化分子修饰时,应避免在强酸、碱溶液中进行,否则极易造成多糖中糖苷键的断裂及构象的改变[5].K.M uha mm ad等[25]对西米淀粉(Sago Starch)进行磷酸化分子修饰,重点研究了p H对磷酸根取代度的影响.在单独用三聚磷酸钠作为磷酸试剂时,在p H值8~10范围内,含磷量随p H升高而逐渐增加.当pH值从弱酸性过渡到弱碱性时,吡喃葡聚糖磷酸化修饰后的磷酸根接枝量是增加还是减少还有待进一步研究.1.1.3多糖分子的乙酰化修饰乙酰化分子修饰是糖类物质的一种常用的分子修饰方法.该方法被成功地应用于纤维素的修饰.在均相体系中对纤维素进行乙酰化修饰后,其溶解性有了较大的提高,产物取代基分布更为均匀,活性也更高[29].Sa m aranayake等[30]报道了一种纤维素乙酰化的新方法,该法的乙酰基取代度低于0.5,以这种低乙酰基取代度的纤维素衍生物为原料进行硫酸化修饰,然后再脱乙酰基,可得到高硫酸取代度且取代基分布均匀、抗H I V活性更高的硫酸化纤维素.乙酰化主要是修饰多糖分子支链,修饰后的多糖溶解度得到较大的改善,其主要原因是乙酰基能使多糖支链得到伸展而发生变化,导致多糖羟基暴露在外,从而增加在水中的溶解度[31].一般来讲,修饰后带有乙酰基的多糖,溶解度增加,有利于活性发挥.斜顶菌多糖(C lito p ilus caes p itos us po l y sacchari d e)经乙酰化修饰后,抑肿瘤活性较修饰前有所提高[32].乙酰化修饰后的壳聚糖也表现出明显的抗肿瘤活性[33].有研究指出,乙酰基的数量和位置可能对多糖活性影响较大[34].O-3位是乙酰基时,多糖抗肿瘤活性最强;而O-5位是乙酰基时,活性明显减弱;O位接上全部乙酰基时,则活性消失.其原因是乙酰基能改变多糖分子的定向性和横向次序,从而改变了多糖的空间排布,因此对其活性产生影响[35].但这一结论与美国学者M c A-nalley的研究相反,他指出多糖中乙酰基含量越高,糖的活性越高.研究证实,乙酰基的数量和位置对多糖的生物活性有重要影响,但其具体作用规律如何,尚有待进一步研究.1.1.4多糖分子的烷基化修饰多糖的烷基化分子修饰是指向主链的还原末端引入长链芳香醇,解决多糖粘度高、溶解度低而不利于活性的发挥等问题.烷基化反应后的多糖分子的水溶性增大,从而使其原有的活性增加.U r yu等[36]最先将烷基引入到硫酸低聚糖,发现烷基化修饰后的硫酸低聚糖的抗H I V活性远远高于修饰前的多糖.在碱性条件下,壳聚糖与环氧丙烷进行羟丙基化反应优先发生在羟基上,得到水溶性的壳聚糖衍生物[37,38].因此,对多糖主链进行适当的烷基化修饰,可以提高其溶解度,充分发挥其生物活性.1.1.5 多糖分子的磺酰化修饰磺酰化主要是向多糖链引入磺酰基,将支链上的羟基进行磺化,增加多糖的未有活性或使得原有活性得以提高.赵吉福等[39]利用碱提酸沉法从茯苓中提取茯苓多糖,再以茯苓多糖为原料用Sm ith 降解方法制备B (1y 3)结合的葡萄糖(新茯苓多糖).以二甲基甲酰胺-三乙胺-氯磺酸为磺化剂,将新茯苓多糖中葡萄糖单位的羟基磺化,制备出能溶于水的磺酰化新茯苓多糖.经过精制后得到磺酰化新茯苓多糖((SNPCP),其中平均每10个葡萄糖组成糖单位中有7个的6位轻基被磺酞化.通过动物实验表明,磺酰化后的新茯苓多糖具有抗肿瘤作用.1.1.6 多糖分子的羧甲基化修饰羧甲基化是向多糖链上引入羧甲基,羧甲基对多糖的生物活性,尤其是抗肿瘤活性具有极其重要的作用.文献[40]报道的羧甲基修饰是用碱液溶解多糖,在氯乙酸中剧烈反应数小时,再用冰乙酸调至中性后醇沉,依次用无水乙醇、丙酮洗涤,真空干燥即得多糖的羧甲基衍生物.陈春霞等[41]用氯乙酸对茯苓多糖(pachym aran )进行醚化,使茯苓多糖变成一种水溶性羧甲基茯苓多糖(C M P),有良好的抗肿瘤活性.龙振洲等[42]通过药理试验证明,C M P 能增强小鼠的免疫功能,表明C MP 是一种抗肿瘤免疫增强剂.虎奶多糖(HNP)是从虎奶菌(P leurotus tuber -reg iu m (Fr .)S i n g .)菌核中提取的一种均一的多糖[43].HNP 几乎不溶于水.王雁等[43]对其进行羧甲基化修饰,得到一种水溶性良好的羧甲基化虎奶多糖(C M -HNP).结果表明C M -HNP 能有效抑制Fe 2+-V C 引起的大鼠肝线粒体脂质过氧化、膜流动性的降低和线粒体的肿胀.1.2 多糖分子的降解修饰1.2.1 多糖分子的酶法修饰酶法由于条件温和,化学、区域和立体选择性高,操作简便,环境友好等特点,在多糖的分子修饰中逐渐受到重视.多糖分子修饰中的酶主要是一类糖苷酶,主要作用于多糖的主链,起到降解的作用,提高多糖的溶解度,从而更有利于活性的发挥.某些革兰氏阳性厌氧菌可产生肝素降解酶,它能特异性地断裂肝素上具有羧甲基、乙酰基等特殊修饰基团的糖苷键[44].Yosh iza w a 等[45]将B -琼胶酶用于条斑紫菜(P or phyray ezoensis )多糖(PASF)的降解,并对酶动力学作了初步研究.结果表明,最初的快速降解阶段发生在不带硫酸基的糖苷键上,然后逐渐地转移到含有硫酸取代基的多糖序列处.酶技术在多糖分子修饰中的应用目前还很有限,积极开发其它类型的酶,如转移酶、水合酶等,将丰富酶技术应用在多糖的分子修饰中,将对多糖的分子修饰带来新的发展.1.2.2 多糖分子的超声波修饰超声波广泛应用于对多种生物大分子(如DNA 、葡聚糖等)的分子修饰.用低频、高强度的超声波通过增加质点震动能量来切断吡喃葡聚糖中的某些化学键,从而降低分子量,增加水溶性从而提高其活性.超声波用于多糖分子修饰的报道虽很少见,但其修饰研究已初具成效.Stahm ann 等[46]研究表明,一种具有B -1,3-D -葡聚糖结构的真菌多糖(cinerean )经过较长时间的超声处理后,分子量比修饰前降低了5倍,经X -衍射分析,ci n erean 超声降解产物的空间结构与具有免疫调节活性的裂褶多糖相似.超声波降解的速率受到多糖浓度、体积、超声辐照时间和反应温度等因素的影响.Chen 等[47]认为,多糖浓度越低,则降解速度越快.另外,增大超声波的强度、施加外压、降低环境温度都能提高多糖降解的速度.1.2.3 多糖分子的酸降解修饰多糖的酸降解修饰方法是较久远的方法之一,主要是通过酸降解多糖,降低多糖分子量,提高其溶解度,使多糖发挥出较高的生物活性.但近年来又有关酸降解多糖的新报道.卡拉胶(carrageenan )是一类红藻多糖,具有明显的抗病毒活性,尤其是抗H I V 活性,已经引起了医药界的广泛关注[48].王长云等[49]用稀硫酸或稀盐酸对卡拉胶进行酸降解,其溶解性得到了大大的改善,因此生物活性的发挥也得到了进一步提高.2 多糖分子修饰的展望多糖衍生物的抗肿瘤活性已经在临床应用上得到了充分的证明,而且多糖衍生物还有许多其它方面的69 3期 张 难,等:多糖的分子修饰研究进展70贵州科学26卷应用,如对纤维素进行化学修饰后可获得离子交换纤维素、抗凝血纤维素等许多有特殊功能的纤维素衍生物,多糖衍生物的抗凝血、抗氧化、抗肿瘤等活性的研究报道也很多.可以说对多糖的分子修饰方法及其分子修饰后获得的多糖衍生物的生物活性的研究意义重大.多糖经分子修饰后获得各种结构类型和各种生物活性的多糖衍生物,为多糖结构与功能关系分析奠定了基础,而结构与功能关系研究结果又指导着多糖分子修饰的方向,为多糖类药物的设计、研究和开发提供理论支持.天然多糖衍生物一般没有细胞毒性且药物质量通过化学手段容易控制,已成为当今新药的发展方向之一,它们在临床应用中显示出广阔的前景,将越来越多地被用作抗肿瘤、治疗艾滋病等抗病毒药、抗衰老药和降血糖药.可以预见,随着多糖分子修饰方法的完善和技术水平的提高,以及基础医学,临床医学不断深入,运用分子修饰手段将开发出更多抗肿瘤、抗凝血、提高免疫力、抗艾滋病病毒等新型药物及保健品.参考文献[1]王庭欣,蒋东升,马晓彤,赵文,秦淑贞,边庆荣.海带多糖对小鼠H22实体瘤的抑制作用[J].卫生毒理学杂志,2000,14(4):242[2]刘伟,查晶,胡一桥.壳聚糖作为缓控释辅料研究的最新进展[J].中国药科大学学报,2000,31(3):234-238[3]王淑芳,张守仁,徐瑞明.团核褐孔菌的培养及其产物生物活性初探[J].中国食用菌,2000,19(6):37-39[4]李作平,章克昌.灵芝胞外生物活性多糖的p 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