转基因动物的应用前景冯彦东，马小军，李越，马志辉，肖海元，马永刚，马聪甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州 (730070)摘要：本文较为全面的综述了各种转基因动物技术的方法，以及提高转基因效率的方法；指出了目前研究中存在的问题，并对其发展前景进行了展望。

关键词：转基因动物、基因、方法、应用、前景科学家预言，21世纪是生命科学的世纪，生物技术产业已成为科学家和企业家开发的热点。

转基因动物技术是21世纪发展最为迅速的生物高新技术之一，是建立在细胞遗传学、分子遗传学、胚胎发育学和DNA重组技术基础之上的生物工程技术。

转基因技术就是利用工程技术的实验手段将特定外源基因导入受体细胞中，由此整合到受体细胞的染色体上，并使外源基因得到表达和遗传的生物技术。

携带外源基因并能表达和遗传的支物称为转基因动物。

转基因技术是新兴的生物技术，具有广阔的应用前景。

目前利用转基因技术获得的主要是粮食作物，其中转基因植物及产品已进入商品化生产阶段。

转基因动物的研究尚处于实验室研究阶段，获得转基因动物技术难度较大。

但它是一种通过对基因的操作，在RNA、蛋白质、形态学或生理学等水平直接观察基因在活体内的活动情况，并观察其表达产物所引起的表型效应的四维实验体系，其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中，既具有深远的理论价值，又有重大的应用价值。

据统计，全球已有以转基因动物技术为核心的公司43家，并将成为21世纪生物技术领域的支柱产业。

1998年全球动物生物技术产品总销售额估计为6.2亿美元，预计到2010年仅在农业领域总销售额将达到110亿美元，其中75亿美元来自转基因动物品种。

而利用转基因动物制作生物反应器生产药品物和功能蛋白的销售市场预计可达500亿美元。

毫无疑问，转基因动物正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学研究与发展面貌。

利用转基因动物技术，既可加快家畜品种的改良速度，提高肉、奶、蛋的产量和品质，又可生产珍贵的药物蛋白，为大量患者造福。

可以说转基因动物技术对于人们千百年来追求的丰衣足食，延年益寿两大目标都会做出具大的贡献。

[1，2，3，4，5，6，7]1 转基因动物的制作方法1.1 显微注射法是由美国人Gordon于1980年首次发明。

显微注射法的制作过程是将SV40的TK基因整合的质粒以显微注射法注入到小鼠受精卵原核中,首次成功地培育出转基因小鼠。

其基本原理是通过显微镜注射将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。

其优点是直接对基因进行操作,整合率较高.缺点是技术难度高,成功率低。

[3，8，15，18]1.2 逆转录病毒传染法此法的研究是1974年Janenissh等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中，获得转基因小鼠。

其原理是利用逆转录病毒的LTRs区域具有的转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTRs的下部进行重组后，再使之包装成为高滴度的病毒颗粒，直接感染受精卵或注入囊胚中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。

逆转录病毒法的优点是操作简单，外源基因的整合率高，动物病毒所具有的启动子不但可以引发一些选择标记基因的表达，还能引发所导入的外源基因的表达，缺点是逆转录病毒载体容量有限，并且外源基因难以植入生殖系统。

成功率较低。

而且逆转录病毒作为载体具有致癌性，所携带的外源基因片段的长度受到限制，一般不超过10kb。

[3，9，11，12，13]1.3 精子载体法Lavitrano等1989年首次报道把PSV2CAT质粒与小鼠的附睾精子共育30min,进行体外受精和移植,获得了阳性鼠并能遗传给后代。

但不少实验利用相似的方法进行研究，未能重复这一结果。

直到十年后Anthomy等才验证了这一事实。

其原理是直接用精子作为外源DNA 载体的基因转移法，精子直接与外源的DNA混合培养，外源基因可以进入精子头部，受精后可以发育成转基因动物。

这种方法的优点是利用精子的自然属性克服人为机械操作给胚胎的损伤，整合率高，成本低。

缺点是结果不稳定。

[8，11，13，14，15，18]1.4 体细胞核移植法1997年，英国PPL公司的科学家Schnieke与罗斯林研究所的Wilmut等联手通过体细胞核移植技术率先在世界上制作了转基因绵羊Dolly。

研究者将人凝血因子IX基因整合到羊胎儿的成纤细胞中，然后用整合了IX基因的羊胎儿成纤细胞作核供体，获得了3只转基因绵羊（其中一只生后不久死去）。

该技术的步骤是：首先将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中有外源基因的细胞进行扩增，再把这种细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中，将重组胚胎进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管进行动物克隆，从而获得转基因动物。

体细胞核移植制备转基因动物总效率高于原核显微注射法，另外可以在核移植前选择后代的性别，产生转基因后代遗传背景及遗传稳定性一致，故不需选配，仅一代就可建立转基因群体，节约时间和费用。

存在的问题是研究基础较为薄弱，体细胞系难以建立，细胞的传代次数有限，成功率低。

[2，5，10，12，15，16，17]1.5 胚胎干细胞法胚胎干细胞(ES细胞,Embryo Stem Cell)j 指囊胚期的内细胞团中尚未进行分化的细胞。

这种细胞具有类似癌细胞无限繁殖和高度分化的潜能，将目的基因转移入ES细胞导入囊胚或经筛选后对转入外源基因的ES细胞进行克隆，可培育转基因个体。

1981年Evans等用不同的培养系统从小鼠囊胚的内细胞团分离开建立了多潜能干细胞。

Bradly等于1984年用显微注射法将从129/SV/EV鼠中分离的ES细胞株移植到胚泡腔，植入受体母鼠子宫，发育成生殖嵌合体。

该方法的优点是操作简单，可对转化的干细胞进行阳性选择，提高了转基因效率；可以克服外源基因随机整和所带来的一些弊端，而且可在体外条件下对外源今音的表达进行筛选，为创造特定的预知转基因动物开拓了一条新的途径。

缺点是第一代一般是嵌合体，很难把外源基因遗传给后代；而动物育种需经过嵌合体途径，受ES细胞的生殖嵌合能力以及交配概率的影响，实验周期较长。

[2，3，5，7，11，12]1.6 人工酵母染色体法人工件木染色体法是近年来发展起来的新型载体，能够克隆出百万碱基对的大片段外源DNA。

该方法可以通过两条技术途径达到转基因的目的。

第一条途径是胚胎干细胞转染酵母人工染色体后，体外筛选。

阳性胚胎干细胞囊胚腔注射；第二条途径是酵母人工染色体的原核注射。

其优点是：（1）保证巨大基因的完整性；（2）保证较长的外源片段在转基因动物研究中的整合率提高；（3）鉴于基因的完整性，目的基因上下游侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的位置不变。

因此，人工酵母染色体法具有广阔的应用前景。

Fujiwara等建立了210KB人工酵母染色体DNA转基因小鼠，在乳腺获得高水平表达人乳白蛋白，而未表现出普通转基因鼠所出现的位置效应。

[5，7，12，13]1.7 基因打靶技术基因打靶技术，也称定位整合技术。

基因打靶的方法是将细胞基因组中的某一序列克隆并加以改造后重新导入细胞中，这一序列就可以与基因组内的同源序列发生重组，从而将改造后的基因转移到基因组没，实现基因的定位突变。

1988年Mansow首次采用该技术使转移基因在体内的定点整个成为现实，产生了敲除特定基因的转基因小鼠。

该技术的方法包括基因敲除和基因契入，同源重组等方法。

此方法的优点在于清除了盲目性和偶然性，并且整合位点，精确表达水平高。

其缺点是产生的串联重复序列不稳定，能自发进行二次同源重组。

[3，5，9，12，14，18]1.8 原始生殖细胞技术原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC S）介导的转基因技术在原理和方法上与ES细胞技术相似。

而且制作转基因家禽方面有明显的优势。

Brimster将ZF-----LacZ系供小鼠的PGC S植入C57B2/6XSTL杂交一代小鼠的曲精管，发现移植后的PGC S能发育成具有受精能力的精子细胞，并能产生后代，Nationtff等于1994年用此方法制作了转基因鸡。

而大家畜PGC S 可否像小鼠ES细胞那样抑制分化并增加，到目前还不能得出确切结论。

如果能，这将为动物转基因带来一场革命。

[8，10]1.9 脂质体介导法将构件的还有外源基因的载体通过用脂质体介导的方法将外源基因转染培养的体细胞，然后，筛选的细胞与转核的卵母细胞融合，经电激活在体外培养至囊胚移入受体,最终获得转基因个体。

脂质体易于制备并具有高效运载DNA片段的能力,其最大特点是可与受体细胞类型发生结合,受体细胞会将含外源基因的脂质体吞噬进来,从而实现了基因转移.岳军明等采用阳离子脂质体介导技术将人EPO基因转移到小鼠体内,为贫血病人的基因治疗提供了科学依据。

[5，18]1.10 电击法电击法又叫电穿孔法，电脉冲刺激法或电场转移法。

其原理是外界的高电压脉冲可以改变细胞膜的结构，使膜产生可变性的电穿孔，从而使得一定大小的DNA分子通过细胞膜进入细胞核，并进一步整个到宿主DNA上。

1992年，Lonue等利用该方法在鱼类的转基因研究中获得成功。

许丽艳等利用该方法制作了转人A Y W基因家蝇。

[3，5，18]1.11. 胞质内显微注射法鉴于精子载体法存在较大争论，1999年Authony CF perry 等预先将小鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白GTP或ß—半乳糖苷酶报道分子的外深DNA短时间共孵育，然后微注射入减数分裂Ⅱ期的卵母细胞中，最后可获得转基因的表达胚胎，然后通过胚胎移植能得到转基因动物。

[7，13，17]1.12 扎刺法.这种方法是先将胚胎放在含有目的基因的培养液里，然后用针扎到细胞或细胞核里。

针快速拔出，此时外源基因就进入细胞核。

细胞膜结构的流动性随之而关闭，胚胎内进入的溶液很少。

这种方法比显微注射快，对胚胎损害小，但转基因频率低。

[3]除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。

如畸胎瘤细胞介导法，激光导入法，受体介导法，染色体片段显微注射法，高效微弹法等，但均因不太成熟不能广泛使用。

综上所述，虽然目前使用的制备转基因动物的方法也不少，但总体看来，仍不是十分理想，效率较低。

[7]2 提高转基因效率的方法[7,15]转基因的效率主要体现在导入基因的整合与表达上。

转基因在宿主体内的整合与表达一直是转基因基础研究的热点。

主要表现在两个方面，一是基因构件的设计和转基因阳性胚的筛选方法，二是对“位置效应”有缓解作用的特殊DNA序列的研究和基因共转移的探索。

2.1 基因构件的设计2.1.1 启动子和内含子启动子决定了外源基因在体内能否表达及表达效率的高低。