3%的邻苯基苯酚、3%的碘化合物。
3.3样品处理
组织样本 用磷酸盐缓冲液制备成 10%(w/v) 的均质组织悬液 分别从组织的三个不同位置取样，手术剪剪取样品约0.2~0.5g，加入含有1mL无菌PBS （0.01mol/L，pH7.2~7.4）的离心管中（已添加灭菌钢珠），使用高通量组织研磨仪进行研 磨处理（70Hz，120s）； 组织样品的处理需在二级生物安全柜中进行； 勿使液体溅到生物安全柜中。如不慎溅出，立即 使用2%NaOH喷洒覆盖溅出处一段时间消除污染
• pH 4~11.5 无血清 4~13.4 有血清
未熟肉品、腌肉、泔水中可长期存活
乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活
在污染的猪圈中，1个月保持感染性 带血木板中可存活70d 在腐败的血中可存活15周 4℃条件下，感染猪血液中病毒感染力可以稳定保持18个月以上 骨髓和未煮熟的香肠、肉片和干火腿中存活3～6个月 冷冻病死猪尸体中15年保持存活
3.3样品处理
饲料样本 处理方法与组织样本相同。
全血（抗凝血）或血清 直接吸取，无需进行处理。
拭子 含液体拭子：直接吸取，无需进行处理。 无液体拭子：添加PBS液，浸泡20min，捻干拭子，即可。
3.4 样品灭活
60 ℃作用30min可彻底灭活病毒。
3.5 核酸提取
核酸提取方法选择： 抽提法-步骤繁琐、成本低 柱式提取-方便操作、成本高 自动提取-方便、自动
反应体系和循环条件：
PCR步骤
激活Taq酶
温度
95℃
时间
30s
循环次数
1ห้องสมุดไป่ตู้
DNA变性
95℃
5s
引物退火/延 伸
60℃
30s
40
每循环58℃时采集FAM通道中的荧光信号
3.7 结果判定
OIE 结果判定： 40个循环 阳性样品和阳性对照的CT值应＜40.0（强阳性样品 CT 值<30.0 ）
猪瘟病毒 12kb 15 倍
口蹄疫病毒 8kb 24 倍
特点之二：基因多变（两端各有一个高变区，基因型多达22个（目前我国流行的毒 株为p72基因II型，血清群8）
特点之三：生存力强
• 温度： 60℃ 20min 56℃ 70min 25-37℃ 数周 4℃ ＞1年 冻肉 数年~数十年
内高压灭菌。 钢珠、吸头等废弃物应用0.8%NaOH浸泡30min消毒后，置密封袋内高压灭菌。消毒残
液应装入密闭容器内高压灭菌处理。
五、实验室生物安全防护
关于生物安全，常见的误区······· 我负责检测，生物安全与我无关 我的检测任务重要，生物安全分心 我操作的病原只对动物有害，不感染人 仅仅是样品检测，没什么危害 ·······
CADC 45个循环 CT 值< 40.0判定为阳性
3.8 废弃物无害化处理
ASF 实验活动中产生的垃圾、废弃物、余样等，均需进行无害化处理。 最佳的无害化处理方法是121℃高压蒸汽处理30 min。处理完毕，察看高压指 示带变色情况，如果变成间隔的黑色条带，则说明此次高压有效，反之则需要 重新高压。
四、实验室操作注意要点
4.1 个人防护 人员防护
为保护实验人员，防止污染物外 泄，需要对检测人员进行充足的防 护措施：
双层手套、鞋套、连体式防护服、 N95口罩、护目镜
4.2 操作过程注意点
样品处理
ASFV是一类动物病原微生物，必须在符合条件的实验室进行试验（BSL-2） 可以开展检测，并不意味着病毒危害程度的降低、生物安全管理可以松懈； 样品处理必须在生物安全柜中进行，不得在超净工作台中进行； 样品接收环境、样品开箱环节、样品检测完毕后台面及空间均需进行消毒； ASFV检测不允许留样，样品在中间检测环节需做好防护，防止出现遗失误用等情况； ASFV检测如出现阳性，则需将阳性样品送至省疫控中心进行复检，剩余样品进行无害化处理
谢 谢！
而抗体产生的时间较晚，在感 染后7~12天在血清中可以检 测到抗体，持续时间较长，甚 至于终生阳性。
核酸检测技术： 被认为是 ASFV核酸检测的金标准，被用在OIE所有的区域性参考实验室； 可以代替病毒分离鉴定的一种灵敏、特异、快速的ASFV 检测技术； 基因B646L，编码VP72蛋白，全长1938bp，是分子检测技术的理想靶标， 多数PCR均针对该基因； PCR、荧光PCR
非洲猪瘟病毒是： 非洲猪瘟病毒科中唯一成员 兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 唯一核酸为DNA的虫媒病毒 基因组庞大，170～190kb 野猪和软蜱是病毒的储存宿主和传播媒介 只有一个血清型，22个基因型
特点之一：基因组大（170~190kb）
170~190kb
蓝耳病病毒 15kb 12 倍
3.9 实验原始记录
实验的原始记录是开展实验室活动的客观证据，必须真实、准确的记录原 始记录，以方便进行溯源查找。
开展ASF检测实验，必须原始、即时、真实、详实的记录相关操作步骤及 实验内容，以便于后期进行数据溯源（历史性证据） 。
3.9 实验原始记录
原始记录包括： 实验室安全记录 实验原始记录 设备条件监控及检测记录 消毒记录 无害化处理记录
生物安全——警钟长鸣！
从实验室泄露的结果： 人的健康危害 动物的健康危害：发病率、死亡率、经济损失量 经济的损失危害：对经济贸易的影响
实验室人员可能的感染途径： 吸入感染性气溶胶 食入 溢撒，或喷溅至皮肤、黏膜 注射或采血时针头刺伤、刺入 剖检动物时，割伤、划伤或骨刺刺伤 伤口
ASFV主要在网状内皮系统的细胞内复制。可采集的临床样品包括抗凝血、各种组织脏器等。
三、诊断
抗凝血（活动物）
血清
淋巴结
脾脏
扁桃体
肺脏
肝脏
肾脏
棉拭子、粪便
仔猪尸体、流产胎儿
蜱
干燥保存
切勿 冷冻
短期于4℃保存 长期需- 20℃以下冷冻保存
短期于4℃保存 长期需- 70℃以 下冷冻保存
可表现为特急性、急性、亚急性和慢性四种形式。 严重程度与毒株、猪种及流行时间的长短有关。 急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀、网状内皮系统出血为特征 发病后2-10天内死亡，病死率可高达100%。 临床上，与古典猪瘟非常相似，难以区分。 缺少疫苗，唯一的防控措施是净化根除
二、非洲猪瘟病毒概述
4.2 操作过程注意点
注意事项
操作之前要确认生物安全柜和实验室已进行了彻底的卫生消毒处理。 防止样品间交叉污染，（1）使用带滤芯的枪头进行样品吸取；（2）剪取组织时需使用
消毒液进行浸泡消毒后再剪取下一块。 如不慎液体及组织掉落至安全柜台面，则立即使用消毒剂喷洒溅出处消除污染。 剪刀、镊子等均应放入消毒缸进行消毒，并装入密封袋内进行高压灭菌处理。 装有组织样品保存液的容器和盛有组织块的离心管应密封管口，表面消毒后放入密封袋
4.2 操作过程注意点
器械设备、空间处理
样品处理前及处理完毕后均需对生物安全柜进行消毒处理（消毒剂擦拭+紫外灭菌1h）； 可进行高压处理的器械物品需进行高压处理（121℃，30min） 正常情况下，仪器、地面均喷洒消毒。如果出现溢出情况，则先用吸水纸清除污染物，再喷
洒消毒作用30min。
PCR和荧光PCR是国际组织（OIE、FAO）推荐的首选确诊技术，在首发地区应结 合基因测序的方法证实。
3.1样品类型和采集：
全血-抗凝血：PCR 检测和病毒分离的目标样品。 血清：抗体和病毒检测 淋巴结、脾脏：最重要，靶器官 骨髓：保存完好的组织 扁桃体 肺脏、肝脏、肾脏 蜱
淋巴结 肌肉 扁桃体
从实验室泄露的主要可能途径： 工作人员：体外表面污染（衣服、帽子等）、误用或故意； 气溶胶 液体或固体废弃物 仪器设备和材料 样品与试剂 软蜱
开展ASFV检测，要做到：
知
制
认知病原危害
制定控制措施
止
防止事故发生
检测 目标
达到检测目标
建议管理规范： GB 19489-2008《实验室 生物安全通用要求》 NY/T 1948-2010《兽医实验室生物安全要求通则》
依据上述临床剖检症 状，如有疑似非洲猪 瘟样品，重点将发生 变化的部位进行采集
3.2样品包装和运输
冷冻保存，冷藏运输 长期保存在-70℃ 三层包装 耐高压 填充物有冷却材料的聚苯乙烯泡沫塑料盒 附表，具体说明样品的数量和类型、种类、采样地
当实验收到样品后，先在外包装四周喷洒消毒剂。如果外包装是纸箱子，则 打开纸箱子，露出泡沫箱，然后在纸箱子内侧和泡沫箱四周全部喷洒消毒剂， 作用30 分钟（为防止喷洒的消毒液干燥，中途再喷洒一次）。 建议使用的消毒剂：2%NaOH溶液；含2%~3%的有效氯制剂（如84等），
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的、猪的一种急性、烈性传染 病，发病率、致死率高达100%。其危害严重，对养猪业可造成毁灭性打击，引 起巨大的经济损失和社会影响；原发于非洲东南部，主要流行于撒哈拉沙漠以 南的非洲国家、东欧。我国自辽宁发生疫情以来，截止至目前（18.11.13）， 共17个省，62起疫情。
2018年
前言
2018年8月3日，辽宁省沈 阳市沈北新区某养猪场发生非 洲猪瘟疫情，这是我国首次爆 发非洲猪瘟。
非洲猪瘟究竟是什么？作 为检测人员我们该怎么检测？
01 非洲猪瘟概述 02 非洲猪瘟病毒概述 03 实验室诊断 04 实验室操作注意要点 05 实验室生物安全防护
一、非洲猪瘟概述
3 实验室诊断
Part Three
三、实验室诊断
非洲猪瘟病毒： 缺乏预防用疫苗，一旦发生疫病只能采取扑杀、扑灭的措施，这就依赖 于疫病的快速、可靠的早期诊断。 ASF诊断的难度 与其他急性热性出血性猪病的临床症状和病变相似 临床症状可能表现不完整 确诊需要经过实验室诊断