植物材料的固定、包埋和制片一、植物材料的固定和包埋在此过程应注意避免Rnase的污染。

所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。

所用蒸馏水无需用DEPC处理。

所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。

材料取下后应立即固定。

取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。

配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。

300 ml量为例）1、先打开一个60℃左右的水浴锅。

2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。

3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。

4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。

5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。

6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。

7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。

二、固定材料1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。

注意：所固定的材料越小越好，尽可能去除无用多余的部分。

2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。

注意每瓶中的切块数：太多固定不好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。

3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目的。

抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。

抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。

一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。

4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。

5、更换新鲜固定液后，材料在4℃过夜。

注意：甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！多聚甲醛极易飞散；称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭过菌的双蒸水）。

0.85% NaCl 冰浴，30 分钟2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时4、85%乙醇/0.85% NaCl 4℃，过夜50%乙醇后，材料应开始脱色。

/水 4℃，5小时2、100%乙醇 4℃，5小时3、100%乙醇 4℃，过夜注：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。

两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。

室温，2小时2、50%乙醇/50% 二甲苯室温，1小时3、100% 二甲苯室温，1小时4、100% 二甲苯室温，1小时5、100% 二甲苯室温，1小时6、50% 二甲苯/50%石蜡 58℃，过夜（使用熔蜡台）后，应在通风橱中操作，要避免让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。

石蜡（58℃），倾倒时避免产生气泡。

1-2小时，把石蜡装于干净熔蜡管内，置于熔蜡台上熔化备用。

将折好的纸盒于氯仿（废氯仿可回收重复利用）中泡一会，再取出晾干。

包埋蜡块：先准备一盆水放在旁边备用，再将大小合适的纸盒放在熔蜡台上（在纸盒上写明材料的名称等有关内容），将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把材料放到此盒内。

用加热的镊子迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。

用嘴吹气，使石蜡表面凝固形成一层薄膜时，再平放入冷水中，使其尽快凝固，数秒后翻转蜡块。

约半小时后取出，置于有吸水纸的塑料框里晾干。

包埋好的蜡块放入4℃冰箱中备用。

二、载玻片和盖玻片的处理1、将挑好的载玻片和盖玻片放入洗液（2%HCl+70%乙醇溶液：70 ml 无水乙醇+2 ml浓HCl+28ml H2O）浸泡过夜，流水冲洗干净。

2、准备2个烧杯的双蒸水、2个烧杯的95%乙醇和2个烧杯的无水乙醇，将洗好的载玻片和盖玻片依次经过这6个烧杯，在干的纸上蘸干酒精后，于酒精灯上烧干。

3、烧好的载玻片和盖玻片放在折好的锡纸上晾干，最后用锡箔纸包裹。

4、180℃烘5个小时。

5、待载玻片冷却，加4 ul多聚-L-赖氨酸（1mg/ml）于一端。

用盖玻片（已经过180℃烘5个小时处理）的一边接触液滴，进行涂片。

涂片时应观察到“虹膜”的形成。

注意：若涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜，则表明载玻片没有洗干净，必须重洗。

请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。

6、涂片之后放入37 ℃的烫板中干燥过夜（最短可以4小时，水干了即可），准备切片。

经过处理的载玻片应在一周内使用。

7、最后封片用的盖玻片不需作任何处理。

使用前用擦镜纸擦净即可（主要是防尘）。

三、切片和展片1、修块。

将包有材料的小蜡块（包含一个材料）初步修成六面体，粘在硬木块上。

用刀片将蜡块修成梯形，在材料的周围各留2mm的石蜡即可（尽可能少留）。

2、切片。

切片的厚度为7-10 um。

在解剖镜下用暗视野观察蜡带，以决定取舍。

3、展片。

将DEPC处理过的蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上（注意分清哪一面涂有多聚赖氨酸），将蜡带的反面（注意正反面！）漂浮于其上放入烫板上（42℃）进行展片。

蜡带完全展开后（数分钟至几十分钟不等，注意观察以免展过头，以组织不裂开为度），吸去多余的水，用一张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后用吸水纸吸去多余的水。

置于42℃烫板上干燥过夜。

4、切好的片子应尽量在一星期内进行杂交。

植物组织RNA原位杂交第二部分 RNA探针的地高辛标记一、转录模板的线性化要转录的DNA（150-1200bp，无polyA尾）被克隆在合适转录载体的多克隆位点上，多克隆位点的外端带有SP6、T7或T3 RNA多聚酶的启动子，如pSK、pKS、pGEM-T和pSPT18或19。

转录反应开始之前必须将DNA模板在插入序列的一端进行酶切。

为防止转录出非目的的RNA，应选用产生5’端凸出（或平端？）的内切酶，酶切必须完全。

酶切时要同时制备正义和反义DNA模板。

酶切体系：总体积 200 ulO 152或172 ulH210×Buffer 20 ul10×BSA 0或20 ul质粒（1ug/ul） 6 ul酶（10 u/ul） 6 ulRNase（10mg/ml） 6 ul1、质粒终浓度为0.1u g/u l，加入合适的内切酶及缓冲液（200 u l酶切体系），在合适的温度下保温（如37℃，2小时），电泳检查是否酶切完全。

酶切后可以加入等体积的水（200 u l），这样可以减少后面抽提时的损失（注意：此时应该以混合后的体积作为1倍体积）将3M的醋酸钠取出化冻2、酶切后，加入等体积的酚（Tris饱和的酚 pH 7.8，下层溶液才是酚）（200 u l）：氯仿（200 u l）（先加酚，振荡，再加氯仿，振荡）抽提，12000转/分离心，5 min，取上清夜（弃下层有机相）到EP管中。

再加等体积的氯仿（400 u l）抽提，12000转/分离心，5 min，取上清夜（弃下层有机相）到EP管中。

再重复一次氯仿抽提，取上清。

3、在上述水相中加入3M的醋酸钠（中和磷酸基团，有助于沉淀DNA），使终浓度达到0.3M（由最后所得的上清液的体积决定）。

约1分半以后再加入2倍冰预冷的乙醇，置冰上1小时（推荐是-20℃过夜）。

4、样品取出，12000g离心，10 min。

弃上清，加400 ul 70%乙醇，颠倒混匀后再12000rpm离心 10 min。

把残液吸尽后，真空干燥（约1.5 min），重悬于水或1/10 TE（pH 8.0）溶液中使终浓度达0.5-1u g/ul（视最初的质粒浓度来决定应加TE的体积），-20℃保存。

二、RNA探针的标记下午开始做，先将Buffer，DDT，ATP，GTP，CTP和Dig-UTP化冻，不同公司用各自的一套反应体系。

1、标记反应体系：（室温下，以T7RNA聚合酶为例。

）宝丽曼反应体系10 u l DEPC水（要根据模板加样量决定）2.5u l 10×T7转录缓冲液0.5u l RNA酶抑制剂（50u/u l）2.5u l 5mM ATP2.5u l 5mM GTP2.5u l 5mM CTP2.5u l 1mM DIG-UTP1 u l DNA线性模板（0.5-1u g）1 u l T7RNA聚合酶Total: 25 u lPromega的反应体系4-5u l DEPC水（要根据模板加样量决定）5 u l 5×T7转录缓冲液2.5u l DDT(100mM)2.5u l 5mM ATP2.5u l 5mM GTP2.5u l 5mM CTP2.5u l 1mM DIG-UTP1-2u l DNA线性模板(0.5-1u g，视模板浓度而定加样体积)0.5u l RNA酶抑制剂(40u/u l)1 u l T7RNA聚合酶(20u/u l)Total: 25 u lTakara的反应体系4.5u l DEPC水（要根据模板加样量决定）2.5u l 10×SP6转录缓冲液2.5u l DDT(100mM)2.5u l 0.1%BSA2.5u l 5mM ATP2.5u l 5mM GTP2.5u l 5mM CTP2.5u l 1mM DIG-UTP1.0u l DNA线性模板(0.05-0.5u g，视模板浓度而定加样体积)0.6u l RNA酶抑制剂(40u/u l)1.0u l SP6RNA聚合酶(10-50u/u l)Total: 25 u l此时将tRNA(100mg/ml)和3.8 M NH4Ac拿出来化冻并混匀。

2、37℃温育2 小时（此时可跑胶检测转录产物的长度，但多省略）。

3、终止转录反应：75 u l 1xMS2 u l tRNA(100mg/ml)(Sigma, R4251,500 units, Type XXI,Ribonucleic acid, transfer,放在-20℃的EP管；它在万一有RNAase的情况下，则可以保护转录的RNA，牺牲自己去被降解；而且在沉淀的时候可以与合成的RNA共沉淀，尤其在合成的RNA量很少的情况下可以减少损失)1 u l DNA酶（无RNA酶污染的DNaseI(10u/u l)）4、37℃温育10分钟。

5、沉淀： 100u l 3.8 M NH4Ac（可增加离子浓度）600u l 乙醇（冰上预冷）6、-20℃过夜。

（或在干冰上10分钟，时间稍微长点没关系）。

配好明天用的70%乙醇/0.15M NaCl溶液，体积视标记的数量而定，于4℃冰箱存放。