基因工程的运输车载体摘要：基因工程已经成为生物科学中不可或缺的一部分.也是最令人类充满无限遐想的一门科学.自从解开人类基因组后,长生不老等就古老的传说又再度流行起来.尽管现在的基因技术还不能做到让你真的长生不老,但是基因疗法等技术的出现已经让人们看到了基因工程的生命力。

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。

基因载体是作为基因导入细胞的工具。

犹如火箭能把卫星射向九天一样，基因载体可以把目的基因送入靶细胞内，从而发挥目的基因的特定功能。

关键词：基因、载体、运载、自主复制、表达正文：一、质粒载体植物基因工程是近代迅速发展起来的新兴生物技术,它的目的旨在通过导入有用的外源基因，获得转基因植物，以用于物种的改良。

它的出现为农业生产提供了前所未有的机遇和挑战,尤其是在作物的抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆及品种改良等方面提供了更为广阔的应用前景。

其中作为基因工程的载体更是基因工程中的不可或缺的一个部分，它是基因工程的核心部分，没有合适的载体，就不能得到合适的结果。

载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。

载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

基因载体是把基因导入细胞的工具，他的作用是一是运载目的基因进入宿主细胞，二是使之能得到复制和进行表达。

按照不同的情况下的作用可以分为不同情况的载体，根据来源：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体；根据用途：克隆载体、表达载体；根据性质：温度敏感型载体，融合型表达载体、非融合型表达载体。

作为载体必须满足的条件：有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；有便于选择的标记基因；具有促进外源DNA表达的调控区。

其中质粒载体是应用较早的一种工程载体。

质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。

它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。

能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。

有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。

质粒的复制分松弛型和严谨型两种。

松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200 拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10 拷贝。

质粒的复制，通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。

在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1 质粒或ColE1 质粒的复制起始位点。

质粒的拷贝数，质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。

严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

质粒的不相容性，两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。

不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。

两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。

转移性，质粒具转移性。

它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。

它需要移动基因，转移基因，顺式因子，及其内部的转移缺口位点。

二、λ噬菌体载体噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。

l 噬菌体基因组为长度约为50kb 的双链DNA 分子，实际大小为48502bp （GenBank 注册号为：J02459 或M17233）。

在噬菌体颗粒内，基因组DNA 呈线性，其两端的5' 末端带有12 个碱基的互补单链粘性末端，叫COS位点。

12 个碱基的序列为5'-GGGCGGCGACCT-3'。

当l 噬菌体DNA 进入宿主细胞后，COS位点两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA 分子，而后在宿主细胞的DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状DNA 分子，充当转录的模板。

同时COS位点也是噬菌体包装蛋白的识别位点，包装范围在35kb－51kb。

噬菌体的基因组可分为3个区域：右侧的DNA复制与调控及裂解相关区域，左侧是头部蛋白和尾部蛋白基因区域，中间为非必需区，可被外源基因取代。

野生型λ噬菌体基因组DNA 为48kb ，若用外源DNA 片段完全替换可取代区，外源DNA 片段的大小将在9-23kb 范围内。

λ噬菌体的选择标记：lacZ 基因lacZ 基因也可用于λ噬菌体载体，通过插入或替换载体中的β-半乳糖苷酶基因片段，在IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。

噬菌体λ载体有两种类型：插入型和置换型。

插入型λ噬菌体是由于改建后的噬菌体λ较野生型短，所以可插入外源DNA。

而且缺失的片段越长，插入的片段越大。

置换型λ噬菌体基因组分三个区域：左侧区域包括外壳蛋白基因，约20kb；中间区域18kb，为不重要的替换区，可被外源基因替换；右侧区域含有复制及裂解基因，约12kb。

λDNA与外源DNA之和必须在39-53kb 之间，所以可插入7-21kb的外源DNA片段。

三、柯斯质粒载体：1978年由Collins和Hohn改建的一种新型的大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体λ的cos位点构成。

一般长为4-6kb。

含有Ampr 和Tetr 抗性基因。

其上的cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白。

凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。

因此，插入柯斯质粒的外源DNA片段的长度可大于40 kb，从而大大增加了载体的携带能力。

粘粒的结构特征和用途：粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有cos 序列的质粒。

粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。

它的大小一般5-7kb 左右，用来克隆大片段DNA ，克隆的最大DNA 片段可达45kb 。

粘粒载体的工作原理：粘粒克隆的主要原理类似l 噬菌体载体。

在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于l 噬菌体载体的左右臂，cos 位点通过粘端退火后，再与外源片段相间连接成多联体。

当多联体与l 噬菌体包装蛋白混合时，l 噬菌体 A 基因蛋白的末端酶功能将切割两个cos 位点，并将两个同方向cos 位点之间的片段包装到l 噬菌体颗粒中去。

这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组DNA 就象l 噬菌体DNA 一样被注入细胞并通过cos 位点环化，这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。

因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。

通过这种方式，就将外源DNA 片段通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中了。

与l 噬菌体载体不同的是，外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。

这样所得到的菌落的总和就构成了基因文库。

四、克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简单的载体。

1．pBR322pBR322 质粒的大小为4361bp ，GenBank 注册号为V0lll9 和J01749 ，含有30 多个单一位点，具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr），其质粒复制区来自pMB1。

目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。

利用四环素抗性基因内部的BamHⅠ位点来插入外源DNA 片段，可通过插入失活进行筛选。

2．pUC18 和pUC19pUC18 和pUC19 大小只有2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA 片段，GenBank注册号为L08752（pUC18）和X02514（pUC19）。

由pBR322 改造而来，其中lacZ （MSC）来自M13mp18/19。

这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。

这些质粒缺乏控制拷贝数的rop 基因，因此其拷贝数达500-700 。

pUC 系列载体含有一段lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。

因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。

除了上面所说的载体，常用的载体还有穿梭载体，穿梭载体是指具有多个复制子能在两个以上的不同宿主细胞复制和繁殖的载体。

表达载体，表达载体是指能将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体。

表达载体的三个系统:DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet抗性基因；目的基因的转录:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等；蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子。

表达载体又分为完整蛋白表达载体和融合蛋白表达载体两类。

该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。

五、载体的应用，抗逆性根据植物抵抗逆境(如抗旱、抗热、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠等) 的生理反应,可以将自然界中多种适应性基因发掘出来,如将大豆的抗热性基因分离并转移到烟草中,并获得了成功。

胡萝卜抗冻蛋白(AFPs) 及其基因的发现,为植物抗寒基因工程注入了新的活力。

1999年,Meyer 等[17 ]用农杆菌介导胡萝卜AFP 基因重组子转化拟南芥,诱导了一系列低温调节蛋白的表达,使未经低温驯化的植株具有较强的抗寒能力。

美国斯坦福大学把仙人掌基因导入小麦、大豆等作物,育成抗旱、抗瘠的新品种。

我国在抗逆基因的分离、克隆和转化等方面的研究也有新进展,克隆的耐盐碱相关基因已在烟草、水稻、玉米和八里庄杨等植物中进行了遗传转化,获得了耐2 %氯化钠的烟草、耐0. 6 %氯化钠的木本植物八里庄杨、耐1. 17 %氯化钠的玉米及耐盐能力达到0. 5 %氯化钠的水稻[18 ] [19 ] 。

2001 年,尹明安等[20 ]根据克隆的胡萝卜AFP 基因,构建成植物表达载体pBAF ,为农杆菌介导转化番茄、甜椒等作物奠定了实验基础。

相信在不久的将来,会有各种具有强烈抗逆特性的转基因植物出现,使它们在逆境中能更好地生存。

参考文献：程业明,王玉民等. 植物基因工程在农业生产中的应用. 吉林农业科学。

解谦. 植物基因工程在农业上的应用[J].大同职业技术学院学报,2004.百度文库，百度百科。