Western bolt
一、实验目的
通过实验了解western blot技术的原理和操作。
二、实验原理
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,简称NC膜),在胶体金试纸中用做C/T线的承载体,同时也是免疫反应的发生处。
NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。
第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。
第二抗体是能和抗体结合,即抗体的抗体,其主要作用是检测抗体的存在,放大一抗的信号。
化学发光HRP底物(辣根过氧化物酶底物,也常被称为ECL试剂)是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。
显影液的A液主要成分为鲁米诺(Luminol)及发光增强剂,B液主要成分为过氧化物溶液。
二抗上含有HRP(辣根过氧化物酶),可以催化A液和B液反应发光。
三、实验器材
1.电泳槽,胶板架子
2.转膜仪
3.NC膜
4.电泳电源
5.滤纸
6.摇床
7.X射线摄影暗匣
8.X射线胶片
9.塑料薄膜
四、实验试剂
1.runningbuffer
5xrunningbuffer(1L)
Tris 15.1g
Glycine 94.0g
SDS 5.0g
ddH2O 定容至1L
使用前稀释5倍
2.Transfer buffer
10×Transfer buffer(1L)
Tris 30.3g
Glycine 144.0g
ddH2O 定容至1L
使用前稀释10倍,加入1/4体积的甲醇
3.TBS
10×TBS(500mL)
Tris 12.1g
Nacl 40.0g
ddH2O 定容至500mL
用HCl调节溶液的pH值至7.6
4.TBST(1L)
1×TBS:Tween-20=1000:1
ddH2O定容至1L
5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)
脱脂奶粉 2.5g
TBST 定容至50ml
6.一抗溶液
7.二抗溶液
8.显影液现配现用,溶液A:溶液B=1:1配置。
9.SDS-PAGE(配方见下一页)
五、操作步骤
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.1SDS-PAGE胶的配置
①先清洗胶板,用去离子水冲洗后放在架子上待干。
②准备好试剂。
③计算所需要使用试剂的量。
例:6%的分离胶,每块胶板分离胶约需要7ml,10块胶,共需要70ml
④将胶板安装在架子上,较低的板朝外,注意底部要平,以防漏胶。
较高的板有正反之分,上面的“up”朝上。
⑤准备配胶按照上面配方依次添加。
注意:1.添加量少的试剂要注意混匀
2.TEMED,APS要最后加
⑥配好分离胶,将胶液注入胶板缝隙中。
注意速度不能太慢,否则胶液会凝,越是浓度高的胶液凝的越快。
⑦分离胶加入后,用异丙醇或水封平胶面,注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢
不要过分冲击胶,否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。
⑧半小时后观察分离胶是否凝结,左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。
凝结后,将异丙醇或水到掉,将架子倒置去除多余的异丙醇或水。
⑨配置浓缩胶,同配置分离胶相似,配方不同。
配好后倒胶。
每块胶用约3ml。
注意不要到过多的浓缩胶,以防插梳子后胶会溢出,倒置在之后用胶前拔梳子的时候出现上扬孔破损现象。
且倒胶后应尽快插梳子,注意梳子有正反。
A.分离胶
B.浓缩胶
1.2 凝胶电泳
①将电泳槽和胶板架子用去离子水清洗干净,把事先准备好的胶板和电泳槽与胶板架子组装好。
注意:胶板较短的一侧朝内。
②往电泳槽内注入running buffer,如果胶板架子和胶板组装的不是很严密需要将running buffer加超过上样孔,但也不要漫过胶板最上方。
③根据自己需求上样。
④盖上电泳槽的盖子,注意电极的正负。
插上电源,打开电源,设置时间和电压。
一般需要设置两次时间,浓缩胶100v,0.5h;分离胶要根据分离胶的浓度和实验的需求而定。
分离胶浓度越低,蛋白样跑的越快。
⑤开始电泳。
2.转膜(半干转)
①转一张膜需准备2张比分离胶部分略大的滤纸和1张与滤纸相同大小的NC 膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。
在转膜前要将NC 膜先放在去离子水中浸泡几分钟,因为直接将NC膜泡在Transferring buffer 中会导致NC膜变的很皱。
(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水。
)
②在加有Transferring buffer 的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、一支试管、滤纸和浸过的膜。
③将转膜仪打开,在上面垫浸泡过的滤纸,用试管取一些Transferring buffer
轻轻倒在上面,再用试管来回擀几遍以擀走里面的气泡。
④在滤纸上摆放好NC膜,注意膜的中间先与滤纸接触,然后两边慢慢放下。
⑤将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。
(撬时一定要小心,玻板很易裂。
)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。
记住正反面,切去一角已标记方向。
⑥小心剥下分离胶去离子水中清洗掉上面的废胶,后用手拿着胶的轻轻置于NC 膜上,注意胶的中间要先与NC膜接触,然后慢慢放下,以防有气泡。
用手调整使其与NC膜对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。
⑦在最上面铺上最后一层滤纸。
⑧用纸吸取多余的Transferring buffer。
⑨盖上转膜仪的盖子,插上电源,打开电源,设置时间和电压,25v,45min。
3.免疫反应
1.取出NC膜于,用剪刀减去多余的NC膜部分,用同样的方法剪去一个角,标记正反。
将NC膜置于TBS中在摇床上摇3次,10分钟/次,倒去TBS液。
2.封闭:加入5%的脱脂奶粉溶液,1h,倒去。
3.一抗(1:10000)孵育4℃过夜。
4.取出NC膜,用TBST在摇床上洗三次,每次15min。
5.封闭:加入5%的脱脂奶粉溶液,1h,倒去。
6.用同样的方法,二抗(1:10000)孵育,1h。
7.取出NC膜,用TBST洗三次,每次15min。
4.显影
①取两张塑料膜,剪成比膜大的相同的大小。
将其中一张铺在X射线摄影暗匣里。
②按照1:1配制好显影液,混匀。
③将NC膜平铺在第一张塑料膜上,将显影液均匀的铺在NC膜上,左右摇晃X射线摄影暗匣使显影液尽量铺满NC膜。
④将第二张塑料膜从左到右或从上到下铺在最上面,用胶布粘住四边固定。
盖好夹子。
⑤在暗室里,打开夹子,取四张X射线胶片将其小心盖在塑料膜上,覆盖住NC 膜。
注意当X射线胶片盖上后就不能再横向移动,否则荧光会错位影响结果。
⑥在暗室里观察荧光情况,若所用的标签蛋白比较亮,就计时1min;否则,计时10min。
盖上夹子,计时。
⑦小心取出X射线胶片,减掉一个角以表明正反。
然后放入自动显影机中显影。
⑧拿到显影后的X射线胶片,用标签笔标记时间,Marker大小,上样信息等必要的数据。