Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
（4℃最多保存一周）13．n%封闭液(一般5%)脱脂奶粉n克溶于100ml 1×TBST，4℃冰箱保存附表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）溶液成分510152025304050 6%水 2.6 5.37.910.613.215.921.226.5 30%丙烯酰胺溶液1234568101.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.32.53.85 6.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.04 8%水 2.3 4.6 6.99.311.513.918.523.2 30%丙烯酰胺溶液 1.3 2.74 5.3 6.7810.713.31.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.32.53.85 6.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.03 10%水 1.94 5.97.99.911.915.919.8 30%丙烯酰胺溶液 1.7 3.35 6.78.31013.316.71.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.32.53.85 6.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 12%水 1.6 3.3 4.9 6.68.29.913.216.5 30%丙烯酰胺溶液2468101216201.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.32.53.85 6.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 15%水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.99.211.5 30%丙烯酰胺溶液 2.557.51012.51520251.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.32.53.85 6.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02附表2 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶（浓缩胶）所用溶液不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）溶液成分123456810 5% 水0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831 1.3 1.71.5 mol/L Tris (pH8.8)0.130.250.380.50.630.750 1.2510% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.1 10%过硫酸氨0.010.020.030.040.050.060.080.1 TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01实验步骤：一、电泳1．制胶：按附表1和附表2配制电泳凝胶，下层为分离胶，上层为浓缩胶；配置分离胶：1）一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速旋动混合物并进入下一步操作。
2）迅速在两玻璃板的间隙中灌注正丁醇或者双蒸水溶液，留出灌浓缩胶所需的空间。
（梳齿长+1cm）3）在凝胶上加满0.1%SDS(也可以用dd水)，将凝胶垂直放于室温下。
覆盖水层可防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应。
4）分离胶聚合后（约30min），倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙稀酰胺。
尽可能地排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体。
配置浓缩胶1）一旦加入TEMED，为防止马上开始聚合，故应快速旋动混合物。
2）在已经聚合的分离胶上快速直接灌注浓缩胶，直到加满后3）立即在浓缩胶中插入干净的梳子，小心避免混入气泡（如果梳子间有气泡，需要从新插梳子）。
4）约30min后凝胶凝聚，小心拔出梳子。
把凝胶固定于电泳装置上,准备电泳缓冲液约500ml,将电泳缓冲液加满电泳槽的中间,保持内外不通且使外面的电泳缓冲液没过电泳槽下面的金属导线。
2．样品处理及加样(1)等质量样品加入等体积2×或4×样品缓冲液，99℃煮5min；（注意：煮样品时不要盖锅盖，以免样品溢出或者盖子鼓开）(2)2000转离心样品10-30秒；样品冷却后，按照预定顺序，根据梳子厚度加样。
（1.5mm 的梳子上样40ul左右, 1mm的梳子加样15ul左右）(3)将样品加入浓缩胶的梳孔中，留一合适的梳孔中加入蛋白Marker；3．电泳装置正负极正确连接后开始电泳，起始电压100V，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电压至120V，待溴酚兰达到底部边缘，即可停止电泳。
二、转膜1．膜的准备。
甲醇浸泡PVDF膜10~15min，转膜缓冲液平衡15~30min。
戴手套，剪一块合适大小的PVDF膜在甲醇中浸泡1分钟。
（注意：当进行接触滤纸、凝胶和膜的操作时，一定要带手套，否则，手上的油脂会阻断转移）。
将500ml转膜缓冲液倒入较大的托盘中，把两块海绵、两块与膜等大的滤纸、已经浸泡好的PVDF膜放入托盘中，充分的浸泡。
2．胶的准备。
将玻璃板撬开，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
（禁止一个位置用力，防止玻璃破碎）撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板，去除浓缩胶，根据目的蛋白的位置，切胶。
胶和PVDF膜、滤纸一样大（注意：撬玻璃板和切胶时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲，最好将撬板蘸水浸湿后再敲胶，可以避免由于胶黏在撬板上而破损）3．装入转膜仪器。
将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。
在上面垫一张纤维垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）。
然后，在垫子上垫一层滤纸。
小心剥下切好的分离胶盖于滤纸上，调整位置，使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
接着，将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后尽量不再移动）并除气泡。
在膜上盖一层滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
（按照：夹子黑面—纤维垫—1张滤纸－凝胶－膜－1张滤纸－纤维垫—夹子白面的顺序排列。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡）。
4．转膜仪器入电泳槽进行转膜将夹子放入转移槽中，使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温，并且使转移槽在冰浴中进行转膜。
加入转膜缓冲液至刚能没过夹子，100V，100min，（蛋白质在转移缓冲液中从负极向正极转移，也就是从夹子的黑面向白面。
对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，时间也要延长一点。
特别是务必注意加强降温措施。
）三、封闭：转膜结束后用封闭液室温摇床封闭1-2小时；四、免疫1．一抗孵育：用n%封闭液适当比例稀释一抗（根据说明书，一般先从1：1000开始摸索浓度，然后根据实验结果调节到合适的浓度），室温孵育半小时后，4℃冰箱孵育过夜；次日从4℃冰箱拿出室温再孵育半小时；2．1×TBST洗膜：10min×3次；3．二抗孵育：用n%封闭液适当比例稀释二抗（根据具体抗体摸索），室温孵育1小时；4．1×TBST洗膜：15min×4次；五、显影1．按膜的大小取适量ECL（等量A液和B液混合），将膜从TBST中取出，用滤纸吸干TBST，将膜蛋白面朝下置于ECL上1 min，然后将膜正面朝上用保鲜膜包裹起来；2．在暗房中，将感光胶片放在膜上，置于X射线摄影暗盒中1～30min，曝光时间取决于样品；3．将感光胶片放在显影液中10sec~1min ,在清水中漂洗后浸入定影液中，至胶片透明。
在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，条带信号弱时，延长曝光时间，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中，待出现明显条带后，即刻终止显影。