培养基的配制和灭菌
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摘要：培养基是人工配制的供给细菌或其他微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

培养基须经灭菌后方可使用。

培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌。

此次实验我们配制LB（Luria Broth）培养基和麦康凯（MacConkey）培养基并进行高压蒸汽灭菌，目的是掌握LB培养基和麦康凯培养基的配制方法，了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围，并且熟悉培养基的灭菌方法。

通过此次实验，我们成功地进行了LB培养基和麦康凯培养基的配制，熟悉了培养基的灭菌方法，达到了预期目的。

关键词：LB培养基麦康凯培养基高压蒸汽灭菌
培养基是人工配制的供给细菌或其他微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

培养基必须具备下列条件：碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子、水分和合适的pH。

培养基种类较多，按其营养物来源不同，可分为天然培养基和合成培养基；按其物理状态分为液体、固体、半固体三种类型。

在一定的条件下，培养繁殖得到的微生物群体叫做培养物。

培养物分为纯培养物和混合培养物。

只有一种微生物的培养物叫做纯培养物，含有多种微生物的培养物叫做混合培养物。

通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，自然环境中极少存在纯培养物，纯培养物通常是由人工方法获得的。

获得纯培养的关键一是所有的相关物品必须无菌，二是分离出单个的微生物细胞并将其培养成一个群体。

因此，无菌技术是保证微生物学研究正常进行的关键。

在分离、转接和培养纯培养时，防止其被其他微生物污染的技术称为无菌技术。

无菌技术包括灭菌和无菌操作。

灭菌是杀死包括芽孢在内的所有微生物。

灭菌的目的是让用于分离、培养微生物的器具和基质事先不含任何微生物。

微生物培养的常用器具（例如试管、三角瓶、培养皿等）和培养基都需要灭菌。

无菌操作要在火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行，并且接种工具（接种环、接种针等）需要灼烧灭菌。

培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。

待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。

高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。

1.材料和方法
1.1材料和试剂
实验试剂：蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaOH、琼脂、麦康凯培养基、去离子水
实验器材：2个300mL三角瓶、2个100mL三角瓶、1个500mL三角瓶、量筒、电子天平、称量纸、称量匙、500mL烧杯或搪瓷缸、试管、pH试纸、电炉、高压蒸汽灭菌锅
1.2方法
1.2.1 LB培养基的配制方法
①清洗三角瓶。

需要清洗2个300mL三角瓶和2个100mL三角瓶。

三角瓶用自来水洗净，
然后蒸馏水冲洗2遍，最后沥干。

②根据LB培养基的配方配制400mL LB液体培养基。

LB液体培养基的配方：1%蛋白胨，0.5%
酵母粉，1%NaCl，用NaOH调pH至7.2。

按下列步骤进行配制：
（1）量筒量取200mL蒸馏水于500ml烧杯或搪瓷缸中，电炉微微加热。

（2）称量4g蛋白胨，2g酵母粉，4g NaCl。

将培养基组分倒入500mL烧杯或搪瓷缸中，并逐一搅拌溶解。

（3）补加剩余蒸馏水，定容至400mL。

（4）用NaOH调节pH值至7.2。

③将400mL LB液体培养基分装。

取2个300mL三角瓶，每个三角瓶加150mL LB液体培养
基，再加1.5%（即2.25g）琼脂。

剩下的LB液体培养基分装到2个100mL三角瓶，每个三角瓶有40～50mL LB液体培养基。

④2个300mL三角瓶和2个300mL三角瓶加塞。

⑤2个300mL三角瓶和2个300mL三角瓶包扎。

⑥标记后灭菌：配制好的培养基及时灭菌，否则低温保存。

灭菌方法：高压蒸汽灭菌。

参
数：121℃，20～30min。

⑦摆斜面。

试管固体一般摆斜面（长度小于试管管长的一半）。

其他根据需要处理。

⑧无菌检查。

1.2.2 麦康凯培养基的配制方法
①清洗三角瓶。

需要清洗1个500mL三角瓶。

三角瓶用自来水洗净，然后蒸馏水冲洗2
遍，最后沥干。

②配制200mL LB麦康凯培养基。

按下列步骤进行配制：
（1）量筒量取200mL蒸馏水于500mL三角瓶。

（2）称量10.4g麦康凯培养基倒入三角瓶中，搅拌溶解。

③500mL三角瓶加塞。

④500mL三角瓶包扎。

⑤标记后灭菌：压蒸汽灭菌。

参数：115℃，30min。

1.2.3 高压蒸汽灭菌操作步骤
①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

②放回内层锅，并装入待灭菌物品。

③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。

再以两两对称的方式同时旋紧相对
的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

④通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，
关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。

当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

⑤灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，
打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

⑥将取出的灭菌培养基放入37℃恒温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

2.实验结果
本次实验我们成功配制了LB培养基和麦康凯培养基，并将两种培养基进行高压蒸汽灭菌。

本次所用的高压蒸汽灭菌锅如图一所示。

高压蒸汽灭菌后的150mL LB培养基如图二所示。

3. 讨论
①
试管和三角瓶的棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。

制作棉塞的过程中要注意棉塞的形状、大小和松紧程度。

②
称量培养基组分的时候需要使用电子天平，要注意电子天平的使用方法，称量的时候要在电子天平上放称量纸，用完及时关闭电子天平的电源。

③ 配制好的培养基及时灭菌，否则低温保存。

④ 灭菌锅使用前切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

⑤ 灭菌锅装入待灭菌物品的时候注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

⑥ 灭菌的主要因素是温度而不是压力。

因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，
维持所需压力。

⑦ 灭菌锅内的压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。

否则就会因锅内压
力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼烧操操作者。

⑧ 500mL 烧杯或搪瓷缸使用完毕后要及时将里面的培养基清洗干净，以防微生物在残留培
养基上的生长繁殖。

参考文献
［1］ 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验.高等教育出版社.1999年6月.
［2］ 周长林.生物学实验与指导.中国医药科技出版社.2004年1月.
［3］ 徐威.微生物学实验（第二版）.中国医药科技出版社.2014年8月.
［4］ 汪天虹.分子生物学实验.北京大学出版社.2009年4月. 图二 高压蒸汽灭菌后的150mL LB 培养基 图一 手提式高压蒸汽灭菌锅。