实验一MS培养基配制和灭菌
一．目的和要求：
1. 学会MS培养基的制作方法;
2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。

二、仪器与试剂
1. 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等
2. 试剂：MS的Macro-e、Micro-e、有机母液、Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉，1N NaoH 和1N HCl
三、方法步骤
（一）配方设计: 以MS为基本培养基（mg/L）
（二）配制培养基
(1)溶化琼脂：量取300ml左右蒸馏水，加入4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全融化。

(2) 各种母液的吸取：Macro-e 50ml
Micro-e 1ml
有机成分1ml
Fe盐5ml
肌醇10ml
加在一起，倒入烧杯（1L)
（3）加入糖:称取30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。

（4）根据实验设计，量取生长调节剂:加在一起，倒入烧杯。

（5）定容:加蒸馏水（用量杯）。

（6）调节pH至，用pH试纸进行测定，用1molHcl或1Mol NaoH调节。

（7）分装:30～40 ml/瓶6，培养基勿碰三角瓶口。

（8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。

（三）灭菌：用高压蒸汽消毒器灭菌，其压力为～,温度为120～126℃，保持15~20 min。

具体操作步骤：
1. 加水；
2. 把包扎好的培养基装入高压锅；
3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀；
4. 加热；
5. 排除冷空气；
6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在1Kg 压力(121℃)下灭菌15~20 分钟即可，但要注意保持稳定压力。

7. 灭菌时间达到20 分钟后，停止加热，待压力自动降到0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。

四.作业
1. 总结配制培养基的注意事项。

2. 制作培养基前为何要提前配制母液
实验二短柄五加无性系建立
一．目的和要求：
1.学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作;
2. 掌握无菌操作技术。

二、材料、仪器与试剂
1.材料：短柄五加休眠枝
短柄五加( Eleutherococcus brachypus Harms.)为五加科五加属灌木，在我国的分布范围极其狭窄，主要分布于西北黄土高原，逐渐被认为是濒危植物。

其茎具有较高的药用价值，有治疗神经衰弱、妇女更年期综合症、继发性高血压、白细胞减少等功效。

2.仪器：超净工作台、灭菌锅、弯头剪、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿等
3.试剂：配制好的MS培养基各种母液、1mol/L的NaOH、1mol/LHCL、%的升汞、70%的乙醇。

三、方法步骤
(一) 无菌操作
准备阶段
接种室：1、紫外灯提前照20-30min。

2、70%乙醇或新洁尔喷雾消毒。

操作人员：1、穿专用实验服，戴口罩。

2、剪短指甲，流水洗手三次。

操作阶段
1、清理工作台面，70%乙醇擦三次。

2、70%乙醇擦手三次。

3、避免说话和来回走动
(二) 无性系建立
1. 配制启动培养基
CK MS
①MS+6-BA 0. 5 mg/L + L
②MS+6-BA mg/L + L
③MS+6-BA 2. 0 mg/L + L
④MS+6-BA 1. 0 mg/L + L
⑤MS+6-BA 2. 0 mg/L + L
2. 材料的选择：选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。

3. 培养步骤：
（1）外植体消毒：
去杂→流水水洗1～2h→70%乙醇（8-10s）→无菌水洗3-5次→%HgCl2（10min）→无菌水水洗5次
（2）接种：
用剪刀将灭菌后的枝条剪成长约1～1.5 cm的单芽茎段。

将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，每瓶只接一个。

对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。

（3）培养：培养物置于25℃左右的培养室中，每天光照12 小时，光照度为850-1200lx。

（4）观察：定期观察培养物的生长情况，及时将污染材料取出。

四、作业
1、总结本实验外植体的消毒过程及关键步骤。

2、进行试验结果的观测、比较和记录，并通过分析筛选出月季无性系建立的最佳培养基配方。

No.
植物生长调节剂
接种数/个萌芽数/个污染数/个萌芽率/%芽生长情况6-BA NAA IBA
CK00 1
2 1. 0
3 2. 0
4 1. 0
5 2. 0。