Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。
如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。
114g Tris-base, 溶于80ml 蒸馏水中，用HCl 调pH 至8.0后，用蒸馏水定容之100ml，高压灭菌，分装保存。
(11)0.5M EDTA (pH 8.0): 称取18.61g EDTA，溶于80ml蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0后，用蒸馏水定容之100ml，高压灭菌，分装保存。
(12)T E buffer ：取1M Tris-HCl (pH 8.0) 5ml，0.5M EDTA (pH 8.0) 1ml，用蒸馏水定容至500ml，调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。
(13)10% SDS：称取10g SDS，溶于90ml蒸馏水中，68℃加热溶解，用盐酸调pH至7.2，定容至100ml。
(14)低严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成2 X SSC，并按照100:1( 2X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成2 XSSC 0.1% SDS。
(15)高严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成0.5 X SSC，并按照100:1(0.5 X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成0.5XSSC 0.1% SDS。
(16)B locking Solution: 用Maleic acid buffer 将6#中的10 X Blocking Solution稀释成1X的工作液，现配现用。
(17)A ntibody Solution :将4#试剂离心，按照1:5000加入Blocking Solution，2-8℃可保存12小时，即每5ml Blocking Solution中加1ul Ab抗体，与地高辛标记探针结合。
(18)C olor substrate solution (显色液)：将5#试剂按照1:50 用Detection buffer稀释，即从5#中取100ul 加入5ml Detection buffer，要避光，现配现用，用于显示抗体结合位点。
(19)杂交液DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 ºC摇动溶解5min。
二、基因组DNA的提取采用CTAB法微量提取植物总DNA：(1) 取叶片0.1～0.2g，剪碎，加入到2mL Eppendorf管中液氮研磨。
(2) 加入2 X CTAB 800μl, 65ºC水浴保温30min，不时颠倒混匀；(3) 加入等体积800μl 的24 :1，混匀10中；(4) 室温下12000rpm离心15min；(5) 重复步骤（3）一次(6) 小心将上清吸入新的1.5ml离心管中；(7) 加入等体积异丙醇，颠倒混匀；(8) -20 ℃放置30min以上，出现絮状DNA沉淀；12000rpm离心15min ，弃掉上清；(9) 75％乙醇洗涤1～2次，晾干沉淀；(10) 加入2uL RNaseA（10ug/uL），37ºC处理20min，除去RNA。
(11) 加40ul ddH2O溶解DNA，-20℃贮存备用三、酶切与电泳分离(1) 酶切反应体系1μg /μl15 μg10×酶切buffer 30 μl限制性内切酶（10U/μl） 6 μl加ddH2O 至300 μl(2) 混匀后于37ºC酶切16h，酶切完成后，取3μl酶切反应物电泳分析，检测酶切效果(3) 酶切完成后，用等体积氯仿抽提，0.1倍体积的3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇混匀后于—20 o C沉淀1h，(4) 12000g，4ºC离心10min，小心弃上清，加入500μl 70% 乙醇洗一遍，离心2 min，弃上清，少量TE或dd H2O溶解。
四、琼脂糖凝胶电泳(1) 用0.5 X TBE 配制0.8% 的琼脂糖凝胶，凝胶厚度约为0.5 cm。
(2) 待凝胶充分凝固后，在点样孔中依次加入：阳性对照：质粒酶切产物，阴性对照：水及检测样品。
(3) 加入电泳缓冲液至刚好与胶面持平，加100 V电压，电泳5 min 待溴酚蓝进入胶中后，将电压降至50 V 电泳3-4 h，(4) 电泳结束后，)染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1 张保鲜膜覆盖在凝胶上，复制下各分子量参照物及各DNA 样品带的位置，在凝胶旁置 1 标尺照像五、变性与转膜(1) 将胶浸于4倍体积的变性溶液中，在摇床上温和摇动2 X 15 min，变性液要能没过胶。
(2) 将胶在双蒸水中稍微洗涤，然后放入4倍体积的中和溶液中，在摇床上温和摇动2 X 15 min，中和液要能没过胶。
(3) 转膜：20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个―桥‖，凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
(4)照凝胶的大小剪一张尼龙膜（长，宽略大0.2cm，剪去与凝胶对应的一角）。
膜放在凝胶上。
(5)尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸（长，宽略小0.2cm）一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
在20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。
(6) 固定：将膜在2 X SSC 溶液中短暂漂洗，除去过多的盐分，然后DNA 结合面朝上，放在一张干净的滤纸上晾干后，夹在两层滤纸中间，120ºC 烘箱中30 min，或者80ºC 2h，促进DNA与尼龙膜结合。
六、预杂交与杂交(1) 预杂交DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 ºC摇动溶解5min，预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度42ºC 。
预杂交60min，在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42ºC下充分润湿。
（此过程可以延长至数小时）(2) 探针变性：Dig标记的探针1ul（约25ng/ml）加40µl H2O, 95 ºC变性10min后迅速放在冰上冷却10min。
(3) 杂交：将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫，倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液，继续在42 ºC下温浴过夜（单拷贝探针）。
含有探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20 ºC保存，可重复使用几次，只需在使用前于68 ºC处理10min即可,不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液七、洗膜与显色(1) 洗膜：2×SSC，0.1% SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。
0.5×SSC，0.1% SDS 65-68ºC温和振荡15分钟，洗2次(2) 免疫与显色：a. 杂交和洗膜后，用马来酸缓冲液（Washing Buffer，Buffer1）浸泡1-5minb. 在100ml 1×Block solution（Buffer2）中温育30minc. 用1×Block solution（Buffer2）稀释抗体–DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000）d. 用10ml antibody solution处理膜30mine. 用100ml马来酸洗膜15min，洗2次f. 在20ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5ming. 在8ml 新鲜配制的color substrate solution中处理膜5分钟，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。
注意不要在显色过程中摇动(颜色沉淀在几分钟内开始出现，在16h内完成显色反应(在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次)。
h. 5h后斑点出现，可在20ml水中洗膜5min中止反应。
i. 结果照像。