生物化学实验报告动物营养研究所张树润2015.10.12猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地1.通过实验了解活性物质的分离提取。
2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。
二．实验原理超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。
该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后，研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其命名为超氧化物歧化酶1-2。
超氧化物歧化酶是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5等）等方面具有了广泛的应用前景。
超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体内的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和O2。
SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。
Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。
SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。
本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。
酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。
该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。
在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000μg。
三．实验试剂与器材1.实验试剂ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等2.实验器材紫外光分光光度计、可见光分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、移液枪、试管架、EP管等。
四．实验方法1.SOD的提取[1]取新鲜猪血20ml于50ml离心管，4000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/min，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，4000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。
[2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。
再向溶血液中缓慢加入预冷的0.35倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，量其体积即为除血蛋白上清体积，留样500ul（样1）。
将上层液用2层纱布进行过滤除去脂肪物质，然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，量其体积即为热变性后上清体积，留样200ul（样2）。
[3]向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置4小时，4000r/min，10min，弃上清液，得沉淀。
将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，为丙酮沉淀后体积，备用（样3）。
2.SOD活力测定[1] 邻苯三酚自氧化率的测定取4.5 ml 50 mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2 ml蒸馏水和1 ml 10 mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20 min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3 ml，迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯内，用10 mmol/L HCl作空白，325 nm 波长下每隔30 s记录光吸收值一次，整个操作在4 min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。
要求自氧化速率引起的吸光值变化控制在0.070/min左右。
[2] 酶活力测定样1、样2及样3中SOD酶活力测定操作与[1]基本一致，加入邻苯三酚前，先加入20µl SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。
[3]酶活性单位计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：单位活性（U/ml）= ×反应液总体积数×其中，A o为邻苯三酚自氧化率；A m加酶后邻苯三酚自氧化率。
总活性(U)＝单位活性×酶原液总体积[4]蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）⑴标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：试剂管号1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水（ml） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝G-250(ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(µg) 0 20 40 60 80 100盖上塞子，摇匀。
注意各管振荡程度尽量一致。
在595nm波长下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。
以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
⑵样品中蛋白含量的测定将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取3支试管，分别加入20μl、50μl、100μl的样1、样2和样3，再分别加入980μl、950μl和900μl蒸馏水，3支试管中都加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。
⑶蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(µg)，计算其浓度。
[5] 结果处理利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。
比活力（U/mg）=单位活力（U/ml）/单位蛋白质浓度（mg/ml）=总活力（U）/总蛋白质（mg）将测得的数据或计算结果填入下表：酶液总体蛋白质酶活性总活性比活性回收率积除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀后体积五．实验结果1.SOD活力测定将含有SOD的样1、样2、样3加入含邻苯三酚的反应液中，记录加样体积及每30秒的吸光度值，与邻苯三酚的自氧化率记录如下表：吸光度值A325计时（秒）邻苯三酚自氧化加邻苯三酚后自氧化样1样2样330 0.119 0.026 0.015 0.01860 0.145 0.04 0.028 0.0490 0.179 0.056 0.045 0.065120 0.211 0.072 0.061 0.088 150 0.245 0.09 0.078 0.122样1、样2、样3分别为除血蛋白上清、热变性后上清、丙酮沉淀后溶于蒸馏水的溶液，加样体积均为20μl。
邻苯三酚自氧化率：A0=[（0.179-0.119）+（0.211-0.145）+（0.245-0.179）] /3=0.064/min加入样1、样2、样3后邻苯三酚自氧化率分别为：A1=0.032/minA2=0.032/minA3=0.047/min邻苯三酚自氧化加邻苯三酚后的自氧化率min-1样1样2样30.064 0.032 0.032 0.047反应液总体积都为10ml，样1、样2、样3均未稀释，即稀释倍数为1，因此，样1、样2、样3SOD的单位活性根据公式：单位活性（U/ml）= ×反应液总体积数×b1=[(0.064/min-0.032/min)/0.064/min×100%]/50%×10×1/20=500 U/mlb2=[(0.064/min-0.032/min)/0.064/min×100%]/50%×10×1/20=500 U/mlb3=[(0.064/min-0.047/min)/0.064/min×100%]/50%×10×1/20=266U/ml样1、样2、样3酶液总体积分别为v1 =3 ml 、v2 =1.1 ml 、v3=1 ml，故其酶总活性分别为：c1= b1 v1=500 U/ml×3 ml=1500Uc2= b2 v2=500 U/ml×1.1 ml=550Uc3= b3 v3=266U/ml×1 ml=266U以除去血蛋白上清液（样1）中的SOD回收率为k1=100%，按酶总活性大小计算各过程中SOD回收率，则样2、样3的回收率分别为：k2= c2/ c1=550U/1500U=36.67%k3= c3/ c1=266U/1500U=17.73%酶活性总活性回收率U/ml U % 样1500 1500 100样2500 550 36.67样3266 266 17.73 2.蛋白质含量测定蛋白质含量与吸光度值A595的标准曲线测定值如下表：吸光度值A5950 0.131 0.253 0.315 0.432 0.508 蛋白质含量(μg) 0 20 40 60 80 100所绘制的标准曲线如下图：y=185.1852x样1、样2、样3的加样量及吸光度值如下表：样品号加样量吸光度值样120 0.317样250 0.106样3100 0.056因此，样1、样2、样3中的蛋白质含量分别为：d1=0.317×185.1852μg/20μl=2.94mg/mld2=0.106×185.1852μg/50μl=0.39mg/mld3=0.056×185.1852μg/100μl=0.10mg/ml所以，样1、样2、样3的比活力分别为：e1=b1/d1=500 U/ml /2.94 mg/ml=170.07 U/mge2= b2/d2=500 U/ml /0.39mg/ml=1282.05U/mge3= b3/d3=266 U/ml /0.10mg/ml=2660U/mg以除血蛋白上清（样1）得到的SOD的纯化倍数n1=1，以各样的比活力计算纯化倍数，则样2、样3的纯化倍数分别为：n2= e2/ e1=1282.05U/mg/170.07 U/mg=7.54n3= e3/ e1=2660U/mg/170.07 U/mg=15.64酶活力测定的结果汇总于下表：酶液总体积蛋白质酶活性总活性比活性回收率提纯步骤ml mg/ml U/ml U U/mg % 纯化倍数除血蛋白上清 3 2.94 500 1500 170.07 100 1热变性后上清 1.1 0.39 500 550 1282.05 36.67 7.54 丙酮沉淀后体积 1 0.10 266 266 2660 17.73 15.64六．讨论分析SOD的制备方法较多, 不同的方法制备的SOD 产品在收率、纯度、比活等方面有较大差别, 各有其优缺点。