实验十阿托品拮抗豚鼠回肠M受体的pA2值测定
071232001 陈小凤2010/5/9
【目的】1．掌握pA2值的测定方法及其意义。

2．观察阿托品对豚鼠回肠M受体的竞争性拮抗作用。

3. 了解离体平滑肌基本实验方法。

【动物】豚鼠
【药物】①乙酰胆碱（2X10-5、2X10-4、2X10-3 、2X10-2 、2X10-1 、2mol/L）
②阿托品（5×10-5、5×10-4 、5×10-3 mol/L ）
③台氏液
【器材】： 100μl微量注射器、量筒、培养皿、缝衣针、缝线、洗瓶、RM6240多媒体化生物信号记录分析系统、肌力换能器、HSS-1（B）型恒温浴槽、GW-3G恒温平滑肌槽。

【方法】
1.仪器安装调试：
（1）搭建好仪器后，打开水浴锅电源，使浴槽温度保持在37℃。

清洗浴槽，加台氏液20ml。

通气，使气泡呈碎花状释放。

（2）启动计算机，双击RM6240生物信号采集处理系统，打开“阿托品拮抗豚鼠回肠M受体的pA2测定”，设置实验参数，示波。

2.标本制备：
豚鼠回肠由教师制备提供。

取豚鼠回肠约2cm，对角结扎，一端固定在浴槽的通气钩上，另一端垂直连接于肌力换能器的感应片上，调节基础张力约为0.5g（记录过程中张力持续变大并出现波动）。

肠管在槽内稳定十五分钟后，记录正常收缩活动。

3.观察项目
（1）未加阿托品时每个Ach累积（ml/L）引起的肠管最大收缩幅度。

（2）分别加入阿托品（3个浓度）后，每个Ach累加浓度引起的肠管最大收缩幅度。

4.给药方案（给药量如表一所示）
（1）用微量注射器向麦氏浴槽内从低到高加入Ach溶液，当每个浓度引起的肠管收缩反应达到最大时，立即累加另一个浓度，直到收缩反应不再增加。

（2）用台氏液冲洗标本3～5次，回肠恢复正常后，加入5×10-5mol/L阿托品20ul后，重复步骤⑴。

（3）用台氏液冲洗标本3～5次，回肠恢复正常后，加入5×10-4mol/L阿托品20ul后，重复步骤⑴。

（4）用台氏液冲洗标本3～5次，回肠恢复正常后，加入5×10-3mol/L阿托品20ul后，重复步骤⑴。

5.数据处理
【结果】
由于我们组实验过程中，未能在每个浓度引起肠管收缩反应达到最大时及时加入药品，并且实验过程中时不时碰到悬挂的吊线，造成实验结果有较大偏差。

因此，我们借鉴了周三第3组的实验数据进行分析。

图一乙酰胆碱累积给药及张力变化汇总
以下分别就各阿托品浓度（0、5*10-8、5*10-7、5*10-6 mol/L）的拮抗作用分别分析。

图二 Ach累积给药张力变化
（阿托品=0 mol/L）
图三 Ach累积给药张力变化
（阿托品=5*10-8 mol/L）
图四 Ach累积给药张力变化
（阿托品=5*10-7 mol/L）
图五 Ach累积给药张力变化
（阿托品=5*10-6 mol/L）
首先，区域测量导出结果绘制下表。

表一乙酰胆碱累积给药及张力变化
Ach浓度加药量Ach终浓度
负对数加入阿托品后肠管最大收缩高度（g）
（mol/L）（ul）（mol/L）05×10-85×10-75×10-6 2×10-51010-880.87 1.1090.2360.042 203×10-87.5 1.01 1.5330.0730.01
7010-77 1.266 3.230.0550.012 2×10-4203×10-7 6.5 1.4710.9080.0590.02 7010-66 2.110.8730.1360.013 2×10-3203×10-6 5.5 2.570.8650.2250.04 7010-55 2.940.8530.2260.014 2×10-2203×10-5 4.5 2.72 1.1910.0550.261 7010-44 3.15 1.603 2.070.067 2×10-1203×10-4 3.5 3.08 2.280.7990.013 7010-33 2.8 2.570.6810.014 2203×10-3 2.5 3.06 3.3 2.070.645
由上表可知乙酰胆碱引起最大收缩高度Emax=3.3g。

然后，计算每个Ach浓度下收缩高度与最大收缩高度的比值E/Emax，列于表二中。

表二阿托品对乙酰胆碱引起豚鼠回肠平滑肌收缩量效曲线的影响Ach浓度加药量Ach终浓度加入阿托品后张力变化E/Emax(%)
（mol/L）（ul）（mol/L）05×10-85×10-75×10-6 2×10-51010-826.433.67.2 1.3
203×10-830.646.5 2.20.3
7010-738.497.9 1.70.4 2×10-4203×10-744.627.5 1.80.6
7010-663.926.5 4.10.4 2×10-3203×10-677.926.2 6.8 1.2
7010-589.125.8 6.80.4 2×10-2203×10-582.436.1 1.77.9
7010-495.548.662.7 2.0 2×10-1203×10-493.369.124.20.4
7010-384.877.920.60.4 2203×10-392.710062.719.5由RM6240生物信号采集系统药理分析工具箱中的激动药pD2和pA2工具，绘制量效曲线及计算EC50。

I.阿托品=0 mol/L 时PD2计算结果：y——张力百分率(％)；
x——乙酰胆碱浓度(－㏒mol/L)
回归曲线方程：
y＝138.92－13.45x
pD2:当y＝50时,对应的x值。

pD2＝6.61(－㏒mol/L)
II．阿托品=5*10-8mol/L 时PD2计算结果：
y——张力百分率(％)；
x——乙酰胆碱浓度(－㏒mol/L)
回归曲线方程：
y＝86.03－6.61x
pD2*:当y＝50时,对应的x值。

pD2*＝5.45(－㏒mol/L)
III. 阿托品=5*10-7 mol/L 时PD2计算结果：
y——张力百分率(％)；
x——乙酰胆碱浓度(－㏒mol/L)
回归曲线方程：
y＝62.12－8.62x
pD2*:当y＝50时,对应的x值。

pD2*＝1.41(－㏒mol/L)
IV. 阿托品=5*10-6mol/L 时PD2计算结果：
y——张力百分率(％)；
x——乙酰胆碱浓度(－㏒mol/L)
回归曲线方程：
y＝11.39－1.62x
pD2*:当y＝50时,对应的x值。

pD2*＝-23.88(－㏒mol/L)
V. PA2计算结果:
A1＝㏒^-1(pD2):表示未加入阿托品前乙酰胆碱产生50％最大效应所需的克分子浓度。

A2＝㏒^-1(pD2*):表示拮抗剂阿托品存在时激动剂产生相同效应所需的克分子浓度。

(A2－A1)／A1:表示达到原有效应所需增加激动药乙酰胆碱额浓度占原用激动药浓度的百分比。

y —— ㏒(A2／A1－1);x —— 阿托品浓度(－㏒mol/L) 回归曲线方程：y ＝104.76－14.68x
pA2:当A2＝2*A1时;即y ＝0时,对应的x 值。

pA2＝7.14(－㏒mol/L)
-20
20406080100120-10
-8
-6
-4
-2
logAch
E /E m a x
阿托品为0
阿托品为5*10-8阿托品为5*10-7阿托品为5*10-6
多项式 (阿托品为0)
多项式 (阿托品为5*10-8)多项式 (阿托品为5*10-7)多项式 (阿托品为5*10-6)
图六 Ach 的量效曲线
【思考】
1、拮抗药(antagonist)：与受体有亲和力，而无内在活性的药物（α= 0）。

①竞争性拮抗药(competitive antagonist)与激动药竞争同一受体的拮抗药。

激动药的量效反应曲线可以被竞争性拮抗药平行右移。

如果增加竞争性激动药浓度，仍可达到Emax。

②非竞争性拮抗药（noncompetitive antagonist）与激动剂作用于同一受体，结合牢固，分解慢或是不可逆的，或作用于相互关联的不同受体。

2、PA2值
PA2是一种用以表示竞争性拮抗剂作用强度的指标，其意义是能使激动剂提高到原来的2倍时，可产生与原来浓度相同效应所需的拮抗剂克分子浓度的负对数(-log(B))。

PA2的值越大说明拮抗剂的作用越强。

pA2是拮抗参数(antagonism parameter)：当有一定浓度的拮抗药存在时，激动剂增加2倍时才能达到原来效应，此时拮抗药的负对数即拮抗参数，pA2 = -log[I] = -logKI
3、药物作用
乙酰胆碱作用于豚鼠回肠的M受体，引起肠肌收缩，当加入M受体拮抗剂阿托品后，若提高乙酰胆碱浓度，仍能达到未加拮抗剂前的最大反应，并可使剂量反应曲线平行右移，则表明阿托品对乙酰胆碱呈竞争性拮抗。