１．２．１大鼠血管内皮细胞分离和培养：取２５０９的ＳＤ大 鼠１只，断颈处死，无菌条件下剖开胸腔，取胸主动脉２－３厘 米，ＰＢＳ冲洗清除血细胞。翻转血管，结扎两端，注入ｌｇ／ Ｌ（Ｏ．１％）胶原酶于３７℃消化１５～２０ ｍｉｎ。收集消化液，１０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｒａｉｎ，沉淀用内皮细胞完全培养基重悬，接种于 六孔板（Ｃｏｍｉｎｇ，美国）中，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱中常规 培养。血管内皮细胞完全培养液成分：ＤＭＥＭ基础培养液、
剥离培养孔底部悬浮于培养液中，镜下观察可见单层ＶＥＣｓ附 着在胶原凝胶底层。然后将ＶＳＭＣｓ细胞悬液按ｌ×１０４／孔密 度沿孔内侧壁轻轻加至浮胶底部，并放入３７＂（２，５％ＣＯｚ培养 箱，隔天换液一次。加入ＶＳＭＣｓ后整个操作过程避免晃动， 防止含有ＶＳＭＣｓ的细胞悬液进入浮胶上层。
１．２．４
１材料和方法
ＲＴ－ＰＣＲ椅测结果表明．４８ｈ共培养组ＶＳＭＣｓ的合成表型相关基因ＣＲＢＰ－ｌ、ｓｍ哪ｂ的表达水平显著高干单独培葬组．分别为Ｉ
４倍，ｌ ５
倍－７２ｈ选到峰值．分别为Ｉ ７倍、２Ｉ倍．９６ｈ开始下降，搀培养组中收缩表！标记物Ｓｍｏｏｔｈｅｌｆａ—Ｂ和ＳＭ－ＭＨＣ的基园表达木平在４８ｈ、 ７２ｈ＆著低于单拙培养组．９６ｈ Ｓｍ∞ｔｈｅｌｉｎ—Ｂ却高于单独培养维。单抽培养组上进备ｇ因的变化趋势Ｔ变或保持稳定。免癌荧光结果显示 ＳＭ—ＭＨＣ＊白表达在共培养组中９６ｈ后从下降转为升高（Ｐ＜０ ０５）。结论在共培养体系中，血管内皮细胞对缸管平滑肌细胞表型转化的作 用表现为先促进向合成型转化，９６ｈ后促进向性缩型转化。 ！＊望ｉ加表型－细胞共培养一血管内皮细胞ｔ血管平滑肌细胞ｔ基目表达
ｃｅｌｌｓ，ＶＥＣｓ）与平滑肌细胞之间的相互作用是悯节
态和生理特性”。平滑肌细胞所表达的肌球蛋白莆链（ｓｍｉｔｈ
ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎ．ＳＭ－ＭＨＣ）和Ｓｍｏｏｔｈｃｌｉｎ－Ｂ是其处
丁收缩状态的标志性蛋白，当平滑肌细胞由收缩型转化为合成 刊时ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ－Ｂ是表达最先下嘲直至消失的标志蛋白”－旺
４８ｈ ａｎｄ ７２ｈ
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Ｓｍｅｍｂ ａｎｄ ＣＲＢＰ－１ ｂｙ ｓｈｏｗｅｄ ａｔｙｐｉｃａｌ ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅⅢｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ
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ｍｉｎ
霉素Ｂ、１０ Ｕ／ｍｌ肝素、１ ｌａｇ／ｍｌ氢化可的松、２０
ｎｇ／ｒｒｄ ＥＧＦ、２
ｎ鲋血ｂＦＧＦ、２ ｍｍｏｌ／ｍｌ Ｌ一谷氨酰胺和２０ Ｉ．ｔｇ／ｍｌ牛脑抽提。细 胞每３天换液一次，汇合达７０～８０％细胞用Ｏ．０２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ ＥＤＴＡ消化传代。并于第二代做ｖ＇ＷＦ鉴定。第４～５代细胞 用于实验。 １．２．２大鼠血管平滑肌细胞分离和培养：取２５０９的ＳＤ大 鼠１只，断颈处死，无菌条件下剖开胸腔，取胸主动脉２—３厘 米，置装有４℃无菌ＰＢＳ液的培养皿中。用眼科镊去除血管外 结缔组织，剖开血管。尽量刮除内膜。用眼科剪将其剪成约１ １１１１／１３的组织块，均匀放于培养瓶底部，翻转培养瓶，并加入 ＤＭＥＭ培养液２ｍｌ，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱中静置１２～２４ ｈ后，再次翻转培养瓶，使培养液浸没组织块，继续培养，每 ３天换液一次。平滑肌细胞培养液成分：ＤＭＥＭ基础培养液、
提说明（申能博彩，生工），分别在１８ｈ，３６ｈ，４８ｈ， ７２ｈ四个时间点收集共培养与单独培养的ＶＳＭＣｓ，并 从总ＲＮＡ中取出２９用于ｃＤＮＡ合成。参与ＰＣＲ的 寡核苷酸正义链与反义链引物序列分别是：ＳＭ—ＭＨＣ
（３７ｌｂｐ）５’一ＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧ－３’，
５’．ＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧ一３’。Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｌｌ－Ｂ
血管疾病中，血管平滑肌细胞（…１＂ｓｍｉｔｈ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
任动脉粥样硬化，高血压，血管成形术后再抉窄等心
ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ，
平滑肌细胞表掣转化的重要凼素，在疾病发生发胜中，内皮
细胞分泌ＰＤＧＦ
ＶＳＭＣｓ）由收缩型转ｆｔ为台成型，增殖和迂移能力显菩增强， 埘疾病的形成和发展有关键作川。血管内虚细胞（ｖａｓｃｕ［ａｒ
１０％ＦＢＳ、１００ Ｕ／ｍｌ青霉素，１００｝ｔｇ／ｍｌ链霉素、ｌ Ｉ＿ｔｇ／ｍｌ两性
（３４０ｂｐ）５’－ＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＡＣＡＡ－３’， ５’－ＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴ乙３’；ＣＲＢＰ－１（２５３ｂｐ）
５’一ＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＧＣＴＴＣ．３’． ５’一ＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣ．３’：ＧＡＰＤＨ
《＆《月８６３＊Ｍ（２００９ＡＡ０２２１１０１ ”ｏ单ｎ：２０００３２±＊．女日＾￥ｈ海‰｛％Ｈｆ＆物｛女％｛
胎型肌球蛋白市链（ｎｏｎ－ｍｏｓｃｌｃ
ｍｙｏｓｉｎ
ｈｅａｗ ｃｈａｉｎ ｉｓｏｆｏｍ—Ｂ，
Ｓｍｅｍｂ）和细胞砚黄醇结合蛋白一１（ｃｅｌｌｕｌａｒ『ｃｔｔｈｏｌ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ｆ｝日槭Ⅻ女镕ｉＨ）
１．１材料：ＳＤ大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。 ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ—ＢＲＬ，美国）；胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， 美国）ｌ羊抗大鼠ＣＤ３１，兔抗大鼠ＳＭ－ＭＨＣ，Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ—Ｂ，
Ｓｍｅｍｂ和ＣＲＢＰ．１均购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司ｌ ＦＩＴＣ－小鼠抗羊
Ｒ．Ｔ—ＰＣＲ基因表达分析：按照总ＲＮＡ抽
Ｃｈｉｎａ；。Ｄ口一“ｆｏｆ№＾ⅫⅡａｎｄＥｎｇｉｎ∞Ｈｎｇ，Ｆｎｄａｎ¨一１口Ｓｈａｎｇｈａｉ，２００４３３．Ｃｈｉｎａ
ｏｆｖ雠ｕ［ａｒ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｔｌｓ（ＶＥＣｓ）ｏＲｐｈｅｎｏｌｙｐｅ
Ｅ＾－’ｘ”ａ“，Ｏｂｊ∞ｄｖｅ Ｔｏ ｏｂｅｓｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅ【ｔｃｃ （ＶＳＭＣｓ）ＭｅｔｈｅｄｓＶＥＣｓ
Ｅｆｆ＊ｌ
ｏｆＶａＫｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉＡｌＣｅｏｓｏＢｎｅ呻帅ｉｃＴｒｌｎｓｉｆｉｏｎ ｏｆＳｍｉｔｈＭｎ＂ｌｅＣｅｌｌｓ
ＬｉＸｉａｏ－ｃｏｎｇ’，￡ⅢＳｈｕｉｉ Ｐａｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ，２０００Ｍ
Ｌｕａｎ女ｎｇ’ＷｕＵｕｏ—ｑａ蝌Ｉ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａ ＢｉｏｌｏｇＹ．ＳｈａｎｇｈａｉＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｌｕｃｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｍ
ｔｏ
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９６ｈＶＥＣｓ ｈｅｌｐｔｏｗａｎｓｆｏｍＶＳＭＣｓ ｈｎｍ
ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ
Ｋ Ｌ、。、ｕ
ｒ！Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ；Ｃｏｑｕｌ呲，、‰ｃｕ】ⅡｓｍｉｔｈｍＩＪｓｃ［ｅ
ｃｅｌｌｓ；、缸ｃｕｌⅡｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓ；Ｇ…ｘＤｍｓｓｌｏｎ
ＴＧＦ—Ｄ等细胞因子．影响平滑肌细胞的形
２００４３３
１．ｃＲＢｐ－Ｉ）则与其台成表型相关［３１。
ｔ海，ｉＥ＾｛女￥々Ｉ程半《（Ｅ目ｍ）
ｅ外基质成分之，本
Ⅲｍｎ女：镕§Ａ．Ｅ－ｍａｉｌ：１￥¨＠ｓｈｍｕ
万方数据
Ｒｅｓｅａｒｃｈ
基础研究Ｉ
Ａｒｔｉｃｌｅｓ｜
７９
次实验所采用胶原浮胶共培养系统，为细胞提供了类似生理条 件的培养环境，十分有利于研究两种细胞间的相互作用，同时 通过对共培养体系中ＶＳＭＣｓ表型相关基因的表达情况进行分 析，初步探讨内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响。
ａｔ
ｃＯｎ”ａｗｔｈｅ∞ｎ怕ｃⅢｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐ。ＩＴｌａｒｋｅｒ Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ—Ｂ ａｎｄ ＳＭ—ＭＨＣ