讨论分析
荧光 荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的 荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的 荧光衰减到一定程度所用时间。 荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发 荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发 光较长时间的照射后发生的减弱现象。 淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等 淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等 荧光（标记）物质的保存
1
1
考核
配分与评分标准
序号 3 考核要点 ⑴ 以PBS冲洗抗原 PBS冲洗抗原 基质片 (2) 浸于盛有PBS染 浸于盛有PBS PBS染 色缸中 反复漂洗3 ⑶ 反复漂洗3次 每次5min ⑷ 每次5min 分 值 1 1 评分标准 不符合要求将此分扣 除 得分
1
考核
配分与评分标准
序号 4 考核要点 ⑴ 取出玻片，吹干 取出玻片， (2) 加50l最适工 50l最适工 作浓度的标记抗 体 ⑶ 平置于湿盒内， 平置于湿盒内， 37oC温箱反应 37oC温箱反应 30min 分 值 1 1 评分标准 不符合要求将此分扣 除 得分
其他荧 光免疫 技术
任务过程
复习提问 2′ 2′ 30′ 40′ 10′ 5′ 1′
教 学 环 节
案例导入 讲解与示教 学生操作 讨论分析 评价、考核 评价、 课后思考题
案例导入
患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽3天。体 间断发热五天，伴咳嗽3 患儿， 温最高39 39度 病程第2天查血常规正常， 温最高39度，病程第2天查血常规正常，诊 呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素” 断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天 无明显改变，即而出现咳嗽， ，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性 刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理 刺激性咳嗽，少痰，胸片提示： 增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。 增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。 患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 如何快 速诊断？ 速诊断？
讨论分析
异硫氰酸荧光素(FITC) 异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光色素: 荧光色素:能够产生明显 荧光并能作为染料使用 的有机化合物称为荧光 色素或荧光染料。 色素或荧光染料。用于 标记抗体的荧光色素， 标记抗体的荧光色素， 必须具有化学上的活性 基因， 基因，能与蛋白质稳定 结合， 结合，且不影响标记抗 体的生物活性及抗原抗 体的特异性结合。 体的特异性结合。
实验操作
【结果判断】 结果判断】
1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性； 1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性； 荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色 反之为阴性。 反之为阴性。 2.根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型： 2.根据荧光分布情况 可分为四种荧光核型： 根据荧光分布情况， 均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。 ⑴均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。 ⑵周边型:细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或 周边型:细胞核周围呈现荧光， 无荧光。 无荧光。 斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。 ⑶斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。 核仁型：核仁部分呈现荧光。 ⑷核仁型：核仁部分呈现荧光。
实验操作
实验操作
【注意事项】 注意事项】
1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片 1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片 样品之间防止交叉污染。 。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒 防止干燥。 内，防止干燥。 2.每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。 2.每次冲片应彻底 防止非特异荧光的干扰。 每次冲片应彻底， 3.荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注 3.荧光受温度影响较大 荧光受温度影响较大， 意低温避光保存。 意低温避光保存。
讨论分析
荧光
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后， 起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。 起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一 种可吸收激发光的光便能产生荧光， 种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用 的有机化合物，亦称荧光色素。 的有机化合物，亦称荧光色素。 发生原理---基态 发生原理---基态激发态 基态 产生特点：激发---即刻产生 产生特点：激发---即刻产生 停止激发---瞬间消失 停止激发---瞬间消失 种类---光致荧光 化学荧光， 线荧光， 种类---光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光 光致荧光，
讨论分析
免疫荧光技术免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显 微示踪的精确性相结合。 微示踪的精确性相结合。 以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但 以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、 不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准 不影响其免疫学特性。 试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗 在荧光显微镜下， 体复合物及其存在部位。 体复合物及其存在部位。
实验操作
【操作方法】 操作方法】
1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈 1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温， 自冰箱中取出抗原基质片 标记。 标记。 2.将待检血清和对照血清用PBS作1∶10稀释，用微量 2.将待检血清和对照血清用 将待检血清和对照血清用PBS作 10稀释 稀释， 加样器加50l待检血清或对照血清于基质片上 待检血清或对照血清于基质片上， 加样器加50l待检血清或对照血清于基质片上，水平置 于湿盒中37oC温箱反应30min 37oC温箱反应30min。 于湿盒中37oC温箱反应30min。 3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸 3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸 冲洗抗原基质片 反复漂洗3 每次5min。 中，反复漂洗3次，每次5min。 4.取出玻片，吹干，加50l最适工作浓度的标记抗体， 4.取出玻片 吹干， 50l最适工作浓度的标记抗体 取出玻片， 最适工作浓度的标记抗体， 平置于湿盒内，37oC温箱反应30min。 平置于湿盒内，37oC温箱反应 温箱反应30min。 5.重复步骤3，洗去未结合的荧光抗体。 5.重复步骤 重复步骤3 洗去未结合的荧光抗体。 6.滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。 6.滴加缓冲甘油封片 用荧光显微镜观察。 滴加缓冲甘油封片，
讨论分析
提 出 问 题
展 开 讨 论
讨论分析
免疫荧光技术 免疫荧光技术（ 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免 又称荧光抗体技术。 疫学、 疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建 立起来的一项技术。 立起来的一项技术。
该技术的主要优缺点 主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 主要缺点： 主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决， 结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。 结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
1
考核
配分与评分标准
序 号 5 ⑴ 考核要点 重复步骤3 重复步骤3， 洗去未结合 的荧光抗体 分 值 1 1 评分标准 不符合要求将此分 扣除 得分
荧光免疫显微技术
Laser
FALS Sensor
前向角散射光（FSC）： ）：反映细胞的大小 前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小
讨论分析
荧光免疫显微技术
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
侧向角散射光（SSC）：反映细胞内的颗粒多少 ）：反映细胞内的颗粒多少 侧向角散射光（SSC）：
任务八 任务八 荧光免疫标记技术 荧光免疫标记技术
任务目标
1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在 1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在 医学检验中的应用 知识目标 2.熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器 2.熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器 和设备 3.了解荧光抗体的制备 3.了解荧光抗体的制备 1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备 1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备
实验操作
【应用与评价】 应用与评价】 荧光抗体技术应用较广， 荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定 及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测， 及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测， 免疫细胞表面抗原的检测等。 免疫细胞表面抗原的检测等。 此方法检测ANA，主要用于初步筛查， 此方法检测ANA，主要用于初步筛查，具有简便 快速、敏感等特点。 、快速、敏感等特点。
讨论分析
荧光免疫显微技术 基本原理---荧光显微镜；荧光Ab；标本 （组织或细胞中Ag) 技术类型： 直接法---荧光素标记Ab直接检测 重点 间接法---荧光素标记二抗 补体结合法---荧光素标记抗补体Ab 双结合法---两种荧光素标记Ab
讨论分析
讨论分析
间接免疫荧光检测自身抗核抗体
讨论分析
考核ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
配分与评分标准
序号 考核要点 (1) 抗原基质片，平衡 抗原基质片， 至室温 分值 1 1 评分标准 不符合要求将此分扣除 得分
1
(2) 记号笔画圈标记
(1)
2
待检血清和对照血 清用PBS作 10稀 清用PBS作1∶10稀
不符合要求将此分扣除 1
释 (2) 微量加样器50l待检 微量加样器50l待检 血清或对照血清于 基质片上 水平置于湿盒中37oC ⑶ 水平置于湿盒中37oC 温箱反应30min 温箱反应30min
学生操作
一位学生 操作演示
老师纠正 点评
学生分组 再操作
实验操作
【主要试剂与器材】 主要试剂与器材】 1.抗原基质片 固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切 1.抗原基质片 固定有核抗原， 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。 2.标记抗体 FITC标记的羊抗人IgG，有商品化试剂供 2.标记抗体 FITC标记的羊抗人 标记的羊抗人IgG， 临用时稀释至工作浓度。 应。临用时稀释至工作浓度。 3.0.01mol/L pH7.2PBS。 pH7.2PBS。 4.缓冲甘油 9份甘油和1份PBS混匀。 4.缓冲甘油 份甘油和1 PBS混匀 混匀。 5.待检血清，阴性、阳性对照血清。 5.待检血清 阴性、阳性对照血清。 待检血清， 6.其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。 6.其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。