生物化學實習1緒論(一) 原理1. 光依據其波長來分類：(1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光(2) 400nm~700nm 可見光波長(3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。

核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。

第一單元 生化實驗基本原理及技術2圖1-1光譜儀光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。

1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。

被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。

I ＝I 0 • e -αιI ：穿透光強度I 0：入射光強度α ：溶液吸光係數ι：光路徑長度柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K→ log 10 I 0 / I ＝K ιlog 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A)或光密度值(optical density ；OD)生物化學實習32. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。

比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。

K ＝εcε：消光指數c ：吸光物質濃度I ＝ I 0• 10-εc ιlog 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι當ι（光路徑長度）＝1 cm 時log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。

因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。

圖1-2 22 µM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分光路徑(light path)的條件下測定 波長吸光值第一單元 生化實驗基本原理及技術4(二) 光譜儀的應用1. 呈色反應：如果分子沒有吸光性，可將此分子與其他分子反應，產生具吸光性的有色化合物。

2. 色度定量法：(1) 呈色劑必須過量。

(2) 必須在吸光值與該化合物濃度呈現線性下，得出標準曲線，亦即該化合物濃度之改變必須與吸光值改變成正比。

(3) 色度定量法之最大誤差來源：通常發生在化合物高濃度時，由於其產生數據為非線性反應所致。

應該將未反應之未知溶液重新稀釋後再做一次，切勿直接稀釋已呈色之反應溶液。

(三) 呈色定量：線性反應之標準曲線圖1-3呈色定量反應的標準曲線(四) 光譜儀的構造與性質1. 光源 (Light Source)(1) 鎢絲燈：340~900 nm生物化學實習5(2) 氫-氘燈：200~360 nm2. 波長選擇器 (Wavelength Selector)(1) 單色光純度越高，其靈敏度也越高。

(2) 濾光片 (absorption filters)：能夠將高於及低於特定波長的光遮蔽住。

(3) 較為先進的光譜儀會使用稜鏡 (prism) 或繞射柵欄來產生單色光以克服濾片的缺點。

(4) 狹縫 (slit)：光的路徑中置放一對調節板行成狹縫調整入射光的強度。

(5) 樣品管或比色槽 (sample tubes or cuvettes)：盛裝樣品與空白對照組溶劑的容器必須是相同的。

(五) 光伏特電池或測光光電管-偵測系統中穿透光1. 光伏特電池：硒的電子流其靈敏度很低，且對小於270 nm 及大於700 nm 的波長不敏感。

2. 真空電光管：有兩個電極維持一個電位差，當入射的輻射光投至陰極引起電子的反射(光電效應)，電子會在陽極(正極)被收集，光電流可立即被放大偵測。

3. 光電倍增管(photomultiplier tube ，PMT) ：是一般光電管的衍生物。

有數個中間電極(倍增電極，dynodes) 。

(一) 基本原理：利用分子經過多孔性介質時會有不同移動速度而將其分離的實驗技術稱為層析法。

層析法基本原理為利用各種物質對吸附用的靜相（stationary phase ；固體材料或基質）和流過靜相的動相（mobile phase ；緩衝溶液或溶劑）有不同的親和力而將其分離。

第一單元 生化實驗基本原理及技術6(二) 基礎理論：分配係數及相對移動速度，分離的過程中，分子會被固體材料（靜相）所吸附，需要先定出該分子對靜相及（或）動相的親和力。

圖1-4管柱層析系統1. 分配係數（partition coefficient ；α）：表示一個物質對靜相的親和力。

分配係數數值介於0與1之間。

分配係數α值越大表示該成分對靜相的親和力越大。

數學公式：被靜相吸附的分子數 α＝在靜相與在動相的分子總數生物化學實習72. 相對移動速度：表示分子對動相之親和力，其定義為：分子與動相通過固體材料的相對移動速度。

R f ＝1-α3. 解析度 (Resolution;R) 最大化是任何層析想要達成之目標。

圖1-5層析解析度第一單元 生化實驗基本原理及技術8(三) 層析法動相：等梯度流析 vs.梯度動相流析1. 等梯度流析方式(isocratic)：全程動相特性相同。

2. 梯度動相流析(gradient)：過程中連續改變動相的離子強度、pH 值、配位體濃度或者是有機溶劑雨水溶液的比例。

(四) 層析的種類常用的層析的種類包括：膠體過濾或分子篩、離子交換層析法、疏水性作用層析法、親和性層析法、分配層析法、高效能（高壓）液相層析法。

1. 膠體過濾法(Gel Filtration) 或分子篩(Size Exclusion)(1) 原理：基於特定大小的分子是否有能力進入具有許多孔洞的固體材料或介質，通常使用等濃度的動相。

(2) 膠體過濾層析過程圖1-6膠體過濾層析過程(3) 膠體過濾層析結果生物化學實習9圖1-7 膠體過濾層析結果2. 離子交換層析法(Ion Exchange Chromatography)(1) 原理：利用分子表面帶的電荷對帶電的靜相或固體材料有不同的靜電吸引力來分離物質。

(2) 種類：A. 陽離子交換法(cation ion-exchanger)：靜相帶有負電荷，對溶液帶有正電的分子（陽離子）具有親和性。

最常使用的陽離子交換樹脂是CM 纖維素。

B. 陰離子交換法(anion ion-exchanger)：最常使用的陰離子交換樹脂是DEAE 纖維素。

C. 緩衝溶液：離子交換層析中選擇適合的緩衝溶液，所用的緩衝溶液需能以儘量低的濃度，在所欲使用的pH 值下，提供足夠的緩衝能力，以免影響溶液的離子強度。

在其pK a 處會有最大的緩衝能力。

第一單元 生化實驗基本原理及技術103. 疏水性作用層析法(Hydrophobic Interaction)(1) 原理：用來增進蛋白質與疏水性吸附劑結合的動相條件剛好與增進離子交換樹脂相反：低pH 值和高離子強度。

(2) 高離子強度會消弱蛋白質與吸附劑的靜電作用力，卻會增進疏水性交互作用。

(3) 高離子強度會比低pH 值更為重要，在高離子強度的狀況下，含有極大疏水性的蛋白質只要以C 4管柱就可以吸附，含有較小疏水性的蛋白質則需要C 8或C 10管柱才能吸附。

(4) 要將蛋白質析出，要破壞蛋白質分子與吸附劑之間的疏水性交互作用，只要降低動相的離子強度就可以輕易地將其流析。

4. 親和性層析法(Affinity Chromatography)親和性層析法是發展最迅速的層析法，獲得最大產率及最大純度。

(1) 種類：A. 受質親和性層析法：酵素、配位體。

B. 染料配位體層析法： Cibacron Blue 會和酵母菌中的兩種酵素有極大的親和性；丙酮酸激(p y r u v a t e k i n a s e )和磷酸果醣激 (phosphofructokinase)。

C. 免疫親和性層析法：抗原-抗體交互作用之解離常數（K d ）範圍為10-8至10-10M ，而最高可達到10-12M ，使用單株抗體來進行免疫親和性層析的效果最好。

D. 固定化金屬離子親和性層析法 (IMAC)：以二價金屬陽離(Zn 2+, Fe 2+, Ni 2+,Cu 2+)純化表面含有組胺酸(histidine)的蛋白質，最後以下列三種方式之生物化學實習11一將藉由組胺酸與樹脂結合的蛋白質流析出來：(a) 降低動相的pH 值(b) 添加比在IMAC 樹脂上還強的金屬崁合劑（例如：EDTA ）(c) 增加動相中與蛋白質競爭金屬鍵結之物質的濃度(例如：咪唑imidazole)或組胺酸(histidine)。

5. 分配層析法( Partition Chromatography)通常是應用在定性分析方面（而非應用在製備方面），分配層析法係使用薄板形式來進行層析，其靜相通常是塗抹在玻璃板（硬式）或聚酯膠片（軟式）上的吸附薄層。

(1) 分配層析法靜相/動相分類：A. 正相(normal-phase)分配層析法，靜相帶有極性，而展開用的動相則不帶帶有極性。

B. 逆相(reverse-phase)分配層析法，靜相不帶有極性，而展開用的動相則帶有極性。

(2) 展開樣品的動相溶液：A. 有機溶液－乙醇(alcohol)、t-戊醇(t-amyl alcohol)、乙(acetonitrile)、甲醇(Methanol)。

B. 水性溶劑－醋酸(acetic acid)。

(3) 樣品用相對移動速度(R f )來表示：樣品移動的距離（cm ） 溶劑前緣移動的距離（cm ）R f第一單元 生化實驗基本原理及技術12A. R f 數值越大表示樣品對該動相溶劑有越大的親和性。

B. 分配層析法已經成功地運用在分析蛋白質、荷爾蒙、胺基酸、胺醣類、碳水化合物、核酸、抗生素、脂肪酸、殺蟲劑核一些藥物及代謝的中間產物。

(4) 分配層析法種類A. 使用濾紙當作靜相：濾紙都是由多聚醣所組成的，所以濾紙層析法最常使用在正相模式，及非極性溶液當作動相來展開。

B. 將分子氣化後，再利用其對固體吸附劑的親和性不同來分分子，此方法又稱「氣相層析」(Gas Chromatography)，氣化的樣品送至線圈處的通常是惰性氣體，如氮氣、氦氣、氬氣等。

6. 高效能（高壓）液相層析法(High-Performance （Pressure ）Liquid Chromatography)（HPLC ）(1) 原理：動相流速由HPLC 管柱材質之強度或堅硬度來決定，管柱半徑減少和長度增加都會增加靜相的壓力，在流速固定1 mL/min 狀況下，長度相同的管柱，口徑20 mm 壓力會比口徑5 mm 的管柱少。

目前HPLC 管柱可承受的流速範圍可高至100 mL/min 或低到0.5 mL/min 。