（2）光密度计法 （3）用本法定量，正常人数值为： 白蛋白 54.0 % ~ 73.0 % 540 ~ 730 g/L α1球蛋白 2.8 % ~ 5.1 % 28 ~ 51 g/L α2球蛋白 6.3% ~ 10.6 % 63 ~ 106 g/L β球蛋白 5.2 % ~11.0 % 52 ~ 110 g/L γ球蛋白 12.5 % ~ 20.0 % 125 ~ 200 g/L
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 【实验目的】
1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。
பைடு நூலகம்
【实验原理】
纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性 支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖 类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所 用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近
代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科 研和生产分析工作中。 纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂； 水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶 剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤 纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机 溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相， 有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两 相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配 较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分 配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。 一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf
DNA(或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白 质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液 中加入适 量乙醇，DNA即析出。 为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入EDTA(乙二 胺四乙酸）。
【实验试剂与器材】
1．5mol/LNaCl溶液：将292.3g NaCl溶于水，稀释至 1000ml。 2． 0.14mol／ＬNaCl-0.15mol／ＬEDTA-Na溶液： 溶 8.18gNaCl及37.2gEDTA－Na于蒸馏水，稀释至 1000ml。
实验六
实验七 实验八
血清中总胆固醇的测定 (操作性) 4学时
唾液淀粉酶活性的观察 (综合性) 4学时 维生素C的定量测定 (操作性) 4学时

实验九
脂肪酸的β-氧化 (操作性) 4学时


实验十
琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 (操作性) 4学时
实验十一 酪蛋白的制备 (操作性) 4学时 实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定 (综合性) 3学时
蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全， 并可以稳定1h，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数， 使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg 蛋白质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应反复性好 精度高，线性关系好。
【实验试剂与器材】
1、标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用 0.9%NaCl 稀释到2000ml。 2、0.9%NaCl 3、考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 5%乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释 1000ml，滤纸过滤。 4、待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释200倍。
【实验步骤】
1．薄膜准备 2．点样
3．电泳
4．染色和漂洗
+
白蛋白(A)
α2 α1
β
γ
5．薄膜和透明 6．定量 （1）洗脱法
每种蛋白占总蛋白量的 百分数（ %） 该种蛋白管光密度读数 100% 各管光密度读数之和
注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值 应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。
HCL 9.55 ml，补加蒸馏水至 1000 ml，测试其 pH应 为 8.6。 2 、染色液：取氨基黑 10B 1.0 g，磺基水杨酸 10 g，加冰 醋酸20ml，蒸馏水 400ml，摇匀溶解。 3、漂洗液：2.5％醋酸 4、洗脱液：0.02 mol/L NaOH溶液 5、透明液：无水乙醇7份，冰醋酸3份混合即成。
3．25％SDS溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于100ml 45％乙醇。 ４．0.015mol/LNaCl-0.0015mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液,氯化 钠0.828g及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 5 ．氯仿-异戊醇混合液:氯仿:异戊醇=24:1(V/V)。 6 ． 1.5mol/LNaCl-0．15mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液: 氯化 钠82.8g及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 7 ． 3mol/L乙酸钠-0.001mol／ＬEDTA-Na溶液：称取 乙 酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 8 ． 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇。
实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 【实验目的】
学习常用的DNA分离方法 。
【实验原理】
在浓氯化钠(1-2mol/L)溶液中，脱氧核糖蛋白的溶 解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠 (0.14mol/L)溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核 糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化 钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白 从样品中分别 抽提出来。 将抽提的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，
目 录


实验一
实验二 实验三 实验四 实验五
氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (操作性) 4学时
考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 (操作性) 3学时 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (验证性) 5学时 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 (操作性) 3学时 血液中葡萄糖的测定 (操作性) 3学时
【实验试剂与器材】
（一）仪器 1、电泳仪； 2、电泳槽； 3、恒温水浴箱； 4、721型分光光度计 （二）材料 1、人血清或鸡血清 2、醋酸纤维素薄膜 （三）试剂 1、0.05 mol/L巴比妥钠-HCL缓冲液（pH8.6）：取巴 比妥钠10.3 g，加蒸馏水约800 ml溶解后，加入lmol/L
二、未知样液的测定 另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液 4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读 取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。
【注意事项】
1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测 定吸光度，在这段时间内样色很稳定。 2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验 证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。
图2.层析谱 1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿
5 ．计算 用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿 距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。
【注意事项】
(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指 上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 (2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。 (4) 点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨 基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 (5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。
《生物化学实验》
课程简介
生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课， 本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证 性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、 核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶 活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技 术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学的基本 知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括 经典的、常规的、以及现代的方法与技术。
掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。
【实验原理】
血清中各种蛋白质的等电点不同，在pH8.6的巴比 妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上 蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等， 例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在pH8.6时带的负 电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在 电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在 醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析蛋 白质。
5、漩涡混合器 6、移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2），5ml（×1） 7、分光光度计 8、试管1.5cm×15cm (×8) 9、量筒100ml(×1) 10、电子分析天平 11、试管架(×1)
【实验步骤】
一、标准曲线线的绘制 取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以 A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准 曲线。
（2）酸相溶剂：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比） 2、显色贮备液：0.1%水合茚三酮丙酮溶液 3、V（0.1%硫酸铜）:V（75%乙醇）=2:38溶液。 4、混合氨基酸溶液6mg/ml。 5、滤纸。 6、烧杯10ml（×1）。 7、剪刀。 8、层析缸（×2）。 9、微量注射器10μl （×1）或毛细管。 10、电吹风（×1）。 11、722型（或7220型）分光光度计。
实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 【实验目的】
学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质--染料结合 法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色-棕 黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色 形式，最大光吸收由465nm变成595nm，测定595 nm吸光 的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。
试管号 试剂 1mg/ml标准 蛋白液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 考马斯亮蓝 染液/ml
1 0.1
2 0.2
3 0.3
4 0.4
5 0.5
6 0.6
1
4.0
0.9