(3)室温下轻轻摇匀15min，然后加热沸腾并保持5min，自然冷却。
3、柠檬酸三钠法制备12-30nm胶体金(Frens，1973)
(1)取250ml三角瓶一种，加100ml双蒸水及1ml1%氯化金，加热沸腾；
(2) 取不同量1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30min，溶液颜色一方面变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。
制备好胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当浮现明显悬浮物或沉淀后表达已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如浮现大量胶体金粒子凝集，阐明已通过期。
1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16nm胶体金
(1)取一250 ml三角瓶，加入79ml双蒸水和1ml 1％氯化金，预热至60～70℃。
运用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150nm直径胶体金。但制备大体积胶体金时，胶体金粒子误差也同步增长。因而做单标记时，建议使用该办法制备12-16nm直径胶体金。
除了上述办法外，也可以用磷作为还原剂来制备5nm胶体金，它避免了单宁酸残基问题，但所形成金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备残液需进一步解决，故该办法已经很少使用。
浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所
胶体金免疫标记技术培训班
技术资料
胡东维洪健徐颖
浙江大学
10月
一、胶体金制备
依照不同制备办法，可以制备出直径1－500nm胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范畴内。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量还原剂，可以控制所产生粒子大小。即粒子大小取决于反映溶液中最初还原试剂和还原核数量。还原剂浓度越高，核因而产生胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增长一倍，数量减少为本来1/8。
柠檬酸钠（ml）
单宁酸（l）
胶体金（nm）
4
5000
3
4
4
4
500
6
4
120
8
4
70
10
4
10
16
2、白磷还原法制备5 nm胶体金
(1)取250 ml三角瓶一种，加79ml双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25M K2CO3将溶液调至中性（pH7.0）。
(2)取0.2ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5ml试管中，再加0.8ml乙醚，混匀。取0.7ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余磷溶液用CuSO4进行中和)。
当蛋白前解决完毕后，接着要拟定胶体金与蛋白结合最佳pH值。对于理化性质不拟定蛋白这一步尤为重要。过量蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH值可以形成结合最稳定探针。在高浓度电解质（如NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白适当pH范畴宽窄大不相似。普通选取最小适当pH值为最佳pH值。但有些探针实际状况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最佳。这要靠实验验证。
注意：
(1)由于使用试剂质量及其他方面也许存在误差，以及制备过程中其他问题，胶体金粒子大小及一致性与理论值也许有偏差，因而，在制备完毕后必要进行镜检。如浮现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边沿不清晰等问题，须重新制备。
(2)胶体金溶液最佳保存在4℃冰箱中；也可保存在室温下，普通可保存1-2个月。但决不可保存在0℃如下，否则金粒子发生凝聚。
二、蛋白-金复合体制备
普通以为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因而，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间互相排斥，形成稳定悬浮胶体金溶液。
金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质影响而互相凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白吸附作用取决于pH值，这是因蛋白净电荷取决于溶液pH值，在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因而这时它水化限度最小，最溶液吸附到疏水金粒子表面。但在实际胶体金探针制备中，普通胶体金调节为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有助于结合更稳定。
(2)取一50ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后依照所制备金粒子体积大小加入不同用量单宁酸及等量25mM K2CO3。预热至60～70℃。K2CO3作用是保持溶液中性pH。因而如果单宁酸量少于0.5ml时，对pH影响不大，K2CO3可以省略。
(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。
氯化金极易吸湿，故普通均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因而在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用可以用1.5 ml试管分装为1ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化解决（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可重复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。
在拟定最佳pH值后，最后要拟定最小蛋白量，即可以形成稳定探针蛋白最小量。如果在制备探针时加入太多蛋白，不但导致挥霍，并且更为严重是容易导致探针凝聚，并严重影响标记活性。由于探针溶液中游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少状况下要特别注意。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，可以制备大小相对一致、直径3～16nm胶体金。因而普通胶体金探针均使用该办法进行。但该办法制备胶体金粒子直径范畴较窄，并且残留多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％H2O2可以去除这些残基。双标记或制备5-10nm胶体金时建议使用该办法。
胶体金探针所用蛋白必要要通过前解决，其目在于（1）去除高浓度盐分，高浓度盐分往往干扰蛋白与胶体金吸附结合，或导致胶体金粒子凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同步与各种胶体金粒子结合，影响标记敏捷度和定量分析。（3）使蛋白具备恰当分子量。蛋白分子量过小（30kD），形成蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被以为影响探针敏捷度，特别是已知蛋白构造与活性中心状况下，去除对活性武影响构造某些是提高标记敏捷度，延长探针寿命（防止凝集）有效办法。把分子量过小蛋白与其他蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳探针。