山东大学实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选作者：姚健(201000140136)同组者：刘新强指导老师：林建群(教授)实验日期：2013年5月22日-6月1日微生物大实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命基地班姚健 201000140136摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。

此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。

营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。

实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。

Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that t here’s no auxotrophic bacteria.关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening1引言筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。

本实验选用紫外线为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。

1.1 营养缺陷型营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株[1]。

这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。

在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。

因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。

营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得到原养型。

为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。

1.2 紫外线诱变诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。

诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。

诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。

紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。

它是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原子的内层电子能级提高，但不能使原子失去电子。

紫外线是微生物育种中最常用的诱变剂之一。

由于碱基间电子的相互作用，DNA分子在260nm处有最大的紫外吸收峰，因此决定了紫外线诱导细胞发生突变的有效波长为260nm。

15W紫外灯产生的紫外线中，80%集中在260nm左右，诱变效应良好。

低剂量紫外线可诱变获得较多的正突变，高剂量紫外线则易产生大量负突变，但可获得特性明显改变的突变菌株。

紫外线诱发突变的原理是使DNA同一链上的两相邻胸腺嘧啶之间发生交联，形成胸腺嘧啶二聚体。

在DNA复制时，相应核苷酸无法与胸腺嘧啶二聚体配对形成碱基对，DNA复制中断，引起突变。

当细胞中的DNA 分子含有大量胸腺嘧啶二聚体时，SOS修复机制被激活，DNA被修复，但包含大量错配的碱基对，从而导致基因突变[2]。

紫外线是应用最早的诱变剂。

紫外线诱变具有简便易行、诱变效果良好、可大幅提高菌株的生产特性等优点，迄今仍是实验室和工业上常用的诱变手段。

1.3 缺陷型富集——抗生素法利用青霉素特异性的杀死野生型细胞，保留营养缺陷型细胞的方法。

青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，所以只能杀死生长繁殖中的细菌，而不能杀死停止繁殖的细菌。

在基本培养基中添加青霉素，野生型细菌能够生长繁殖，会被杀死，而营养缺陷型不被杀死，得以浓缩。

本实验采取的筛选方法就是青霉素浓缩法。

1.4 缺陷型检出——点植对照法营养缺陷型的检出是通过一系列培养基实现的。

基本培养基（MM）——能满足野生型和原养型菌株最低营养要求的合成培养基。

完全培养基（CM）——能满足各种营养缺陷型菌株营养要求的天然培养或半合成培养基。

诱变后的菌体经富集培养后，涂布于CM平板上，将长出的菌落按一定排列次序逐个地点种到MM平板、CM平板的相应位置。

培养后，在CM上有菌落生长而在MM的相应位置上没有生长的菌落，可能是营养缺陷型。

挑取菌体分别接种于MM、CM上进一步复证[3]。

图1：点种方格图1.5 缺陷型鉴定——生长谱法在同一平皿上测定一种营养缺陷型菌株对多种生长因子的需求情况，称生长谱测定[4]。

补充培养基（SM）是在MM中有针对地补加某一种或几种营养成分，以满足特定营养缺陷型菌株生长要求的培养基。

将所得营养缺陷型菌株的菌悬液与MM混合倾注平板。

凝固后，在标定的位置上加少量特定的生长因子（氨基酸、碱基等结晶粉末）。

经培养后，出现浑浊生长圈的位置所对应的生长因子即为该营养缺陷型不能合成的营养物质，此菌株即为该物质对应的的营养缺陷型。

2实验材料和方法2.1材料2.1.1菌株：大肠杆菌E.coli K122.1.2培养基（1）LB液体培养基（10mL /100mL锥形瓶×4）：酵母膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100ml，pH7.2，高压灭菌121℃，20min。

LB固体培养基（250mL /500mL锥形瓶×1）：在上述液体培养基中添加,2%的琼脂。

（2）2×LB液体培养基(3mL/试管×2)：酵母膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水50ml，pH7.2。

（3）基本培养基：Vogel 50×（即浓缩50倍）：MgSO4·7H2O 10g，柠檬酸100g，NaNH4HPO4·4H2O 175g，K2HPO4·2H2O 599.88g，水600ml。

使药品溶解后再定容1000ml。

（4）基本固体培养基：50×2ml，葡萄糖2g，蒸馏水98ml，琼脂2g，pH7.0，高压灭菌115℃，20min。

（5）无N基本培养基（5mL /100mL锥形瓶×1）：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，水100ml，pH 7.0，高压灭菌115℃，20min。

（6）2N基本培养基(5mL/试管×1)：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，硫酸铵0.2g，葡萄糖2g，水100ml，pH 7.0，高压灭菌115℃，20min。

2.1.3 试剂蒸馏水、生理盐水（4mL/管×10）混合氨基酸和混合维生素：氨基酸分7组，其中6组每组6种氨基酸，每种氨基酸等量研细充分混合。

第7组是脯氨酸，因为这种氨基酸易潮解，所以单独成一组。

Ⅰ赖氨酸精氨酸甲硫氨酸半胱氨酸嘌呤胱氨酸Ⅱ组氨酸精氨酸苏氨酸谷氨酸天冬氨酸嘧啶Ⅲ丙氨酸甲硫氨酸苏氨酸羟脯氨酸甘氨酸丝氨酸Ⅳ亮氨酸半胱氨酸谷氨酸羟脯氨酸异亮氨酸缬氨酸Ⅴ苯丙氨酸胱氨酸天冬氨酸甘氨酸异亮氨酸酪氨酸Ⅵ色氨酸嘌呤嘧啶丝氨酸缬氨酸酪氨酸Ⅶ脯氨酸Ⅷ把维生素B1、B2、B6泛酸，对氨基苯甲酸（BAPA），烟碱酸及生物素等量研细，充分混合，配成混合维生素Ⅸ空白对照（CK）表1：混合氨基酸配制2.1.4 仪器试管，三角瓶，5mL离心管，移液枪，枪尖，称量纸，玻璃棒，接种环，振荡器，离心机，振荡培养箱，恒温箱，7cm小培养皿1个，9cm培养皿20个，涂布棒，酒精灯，无菌超净台，烧杯，容量瓶，牙签，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，黑布等。

2.2实验方法2.2.1 菌悬液制备（1）用接种环取E.coli K12 一环加入到10ml LB培养液中在恒温振荡培养箱中37℃，150r/min振荡培养过夜。

（2）取0.3ml 菌液转接到10ml LB培养液中，在37℃摇床上振荡培养4—6小时，使细胞处在对数生长期；（3）取适量菌液加入到5ml离心管中，7000rpm离心3—4 min，离心2次，弃上清液，打匀沉淀，加入4ml无菌生理盐水，充分振荡混匀。

2.2.2 诱变处理取3ml菌悬液，加入到7cm小皿内，轻轻震荡使其均匀在皿底形成一薄层。

平放在灭菌的超净工作台上，盖盖灭菌1min，然后打开皿盖照射2.5min，后加入2倍LB培养基3ml，盖上黑布在37℃中黑暗培养12h以上。