细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定
作者：徐艳芹作者单位：山东理工大学生命科学院地址：山
东淄博255049
摘要：营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，是编码代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物（如氨基酸、维生素）的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株。
这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。
在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。
本实验选用紫外线为诱变剂，以大肠杆菌为实验材料来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
通过此过程掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词：营养缺陷性，诱变剂，大肠杆菌，青霉素，氨基酸
1、实验目的要求
了解营养缺陷型突变株选育的原理。
学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
2、实验原理
营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株。
这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。
在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。
营养缺陷型筛选一般分四个环节，即诱变剂处理、营养缺陷型浓缩、检出和鉴定。
诱变处理突变频率较低，只有通过淘汰野生型，才能浓缩营养缺陷型而选出
少数突变抹。
浓缩营养缺陷型有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法四种。
检出营养缺陷型也有逐个测定法、影印培养法、夹层培养法和限量补给法四种。
鉴定营养缺陷型一般采用生长谱法。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
3、实验材料
3.1菌种E.coli
3.2培养基、
①LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min
②2×LB培养液：其它不变，水，50ml。
③基本培养基：葡萄糖 0.5 g，(NH4)2SO40.1 g，柠檬酸钠 0.1 g，MgSO4·7H2O
0.02 g，K2HPO40.4 g，KH2PO40.6 g，重蒸水 100 mL，pH 7.2，110℃灭菌 20 min。
配固体培养基时需加 2%洗涤处理过的琼脂。
全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗 2~3 次。
④无N基本液体培养基：
K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min
⑤2N基本培养基：
K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO47H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min
⑥混合氨基酸和混合维生素：
4、实验步骤
4.1诱变处理
1th day，接种：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜。
2th day，诱变：早上添加5mlLB液，继续培养5小时，倒入离心管中离心（3500rpm）10分钟，弃去上清，加生理盐水5ml，打匀沉淀，吸菌液5ml于90mm培养皿内，
将培养皿置于15W紫外灯下30cm处（处理前紫外灯预热30min），将培养皿连同盖一起置于15W紫外灯下灭菌1min，然后打开皿盖照射90s，照射后先盖上皿盖再关灯。
吸5ml 2倍LB液加入处理过的菌液平皿内，混匀，用黑布（纸）包好，置37℃避光培养12h以上。
4.2营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）
3th day，延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清，加生理盐水至原体积，打匀沉淀，再离心，共两次，最后制成5ml菌悬液。
取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h（消耗体内的N素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死）。
次日早上放4℃。
4th day，初筛：晚上8:00，按1:1比例加入2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml，再放入37℃培养。
（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死亡。
缺陷型因不长避免被杀死）。
5th day，从培养16、24小时的菌液中分别取0.1ml菌液到两个培养皿中，倒入经融化并冷却到45－50℃的基本及完全培养基中，混匀，平放，凝固后37℃培养。
4.3营养缺陷型检出
7th day，检出营养缺陷型。
上述平板培养36－48h后，进行菌落计数。
选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落200个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37℃培养。
9th day，选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线，37℃培养24h，仍不长的是营养缺陷型。
4.4营养缺陷型鉴定
10th day，生长谱的测定：将检出的营养缺陷型菌落接种于5ml LB液试管中，37℃培养14－16h。
11th day，培养16h的菌液离心。
3500rpm，10min，弃上清，加生理盐水，打匀沉淀，再次离心。
加5ml生理盐水制成菌悬液。
取其1ml于培养皿中，加入融化后冷却到40－50℃的基本培养基，混匀，平放，共二皿。
（平板表面分别沾上沾有混合氨基
酸(或酪素水解液)的滤纸片，37℃培养24h，经培养后营养物质周围有生长圈，即表明为氨基酸的营养缺陷型菌株）。
将皿底分成分格用接种环依次放入少许混合氨基酸等，37℃培养24h，观察生长情况，确定是哪种氨基酸营养缺陷型。
5.培养基配置及物品灭菌：
第一天
每组2*LB液体培养基 1管⨯5ml（第2天用）
LB液体培养基约50ml： 1瓶⨯5ml（第1天用） 7-10管⨯5ml （其中第2天用1支，第10天用约6支）
生理盐水 4瓶⨯50ml（或分装试管）
离心管吸头牙签培养皿
每组无N、2N培养基各1管⨯5ml。
4个组无N、2N培养基各50ml，可一起配（配100ml无N培养基，取出50ml，加硫酸铵0.1为2N培养基50ml），分装试管，每管5ml。
第5、7天用基本培养基（约2L/4组）、完全培养基（约1L/4组）、培养皿（约20-25套/组），第9、11天用基本培养基、培养皿。
第1天或者第2、3、4天找时间做培养基，并与其他器皿一起灭菌。
六．结果与分析。