7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
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PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
35
Thanks！
36
压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
三、Western Blot
成像系统
四、Western Blot 常见问题分析
2
一、Western Blot 基本原理
3
一、Western Blot 优点
1. 高分辨率的电泳技术 2. 特异敏感的抗原-抗体反应
对 策
33
四、SDS-PAGE常见问题
• • • • 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲 液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄， “三明治”结构不紧凑导致。 确保膜和胶块之间没有气泡
对 策

缓冲液中离子浓度太低，电流或电
13
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10
12-43
20-80
7.5
5.0
36-94
57-212
14
15
灌制分离胶
隔绝空气
d缩胶
插入梳子
17
上样
Staking gel
Separating gel
18
电泳
19
转膜
半干法
将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸之间， 电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中， 电转4h或过夜。
3. 1-5ng中等大小的靶蛋白
4
一、Western Blot 应用
1. 目的蛋白的表达特性分析 2. 目的蛋白与其它蛋白、RNA的互作
5
二、Western Blot一般流程
蛋白样品的制备 转膜（PVDF或NC膜） 洗涤
SDS-PAGE电泳 封闭 洗涤 一抗 显影
酶标二抗反应
6
蛋白样品的制备
LB： 62.5 mmol/L Tris-HCl （pH6.8 at 25℃）, 2%SDS ，10%Glycerol(甘 油) ，50 mmol/L DTT(二硫苏糖醇) ；溴酚蓝 在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准 确性！
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印 迹法中常用的一种固相支持物。 2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。 3. 预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团， 使其更容易与带负电的蛋白结合。
2.发光试剂；
3.反应的杂质;
27
洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
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Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄； 可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍
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湿转系统
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不同大小蛋白的转膜条件：
转膜
转膜条件
蛋白x(kDa)
转膜液 甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱 （25mM），200ml甲醇（20%， pH8.5），用水定容至。 配方同上
x<20
250mA恒流转3 hrs
20<x<120
250mA恒流4 hrs
120<x<200
甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱 250mA恒流转6 hrs （25mM），200ml甲醇（20%， pH8.5），0.05%SDS，用水定容至。
200<x
配方同上
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500mA恒流转4 hrs
23
半干转移系统
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封闭
为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异
性结合而使非特异性背景提高,需对膜上的潜在结合位点
进行封闭处理。
脱脂奶粉（5％）、BSA（1％）
25
一抗、二抗孵育
1. 加入一抗溶液与滤膜温育，37℃2小时或4 ℃ 过夜。 2. 回收一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次 5min。
胶不平？ 凝胶漏液？
对 策

加入试剂后摇匀，使其充分混合， 防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合 不均匀
两块玻璃板底部要对齐
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四、SDS-PAGE常见问题
凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混 合均匀，动作轻缓 • 条带比正常的窄？ • “微笑”或“倒微笑 ”条带？ 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心 ，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导 致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果， 应赶走气泡。同时注意电泳槽装置 是否合适
摄得高质量的图片；
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Tanon 5200---软件特点
具有序列图像保存功能，无需单张图片分别存储；
具有分析软件，可进行泳道密度扫描、半定量计算， 分子量计算； 图像叠加分析功能：可对两个图像进行合并显示， 并进行分析；
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四、SDS-PAGE常见问题
胶板洗刷干净
加入AP和TEMED的量要合适
8
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形 状像一个长椭圆棒; （2）平均1g蛋白质结合 1.4gSDS; （3）短轴对不同的蛋白质 亚基-SDS胶束基本上是相同 的;
（4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比;
9
蛋白样品的定量
Bradford 法：考马斯亮蓝 G-250 有红、蓝两种不同颜色的形 式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶 液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处 有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 双缩脲法：Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形 成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收 Lowly法：第一步就是双缩脲反应，即Cu2+与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试 剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。 10
3. 加入用TBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动，
室温孵育1-2小时。
4. 倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次
5min，最后一次用TBS。
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二抗与底物反应显色
化学发光显色法(HRP) ECL中的luminol被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被 发光增强剂加强 影响发光的因素主要有： 1.含HRP的抗体；
聚丙烯酰胺凝胶电泳
1. 不连续的电泳缓冲体系。 2. SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白 质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子 量的大小。
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不连续电泳系统
作用
浓缩胶 分离胶
缓冲液PH
凝胶浓度
使蛋白样品浓缩 pH6.8Tris-Cl 低，2-5% 使蛋白样品分离 pH8.8Tris-Cl 高，根据蛋 白大小