芦丁的测定（标准曲线制备与芦丁测定一起完成） 精密移取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0ml和样品液3.0ml置10ml容量瓶中→各加30%乙醇 使成5.0ml→各精密加入亚硝酸钠溶液（1→20） 0.3ml，摇匀，放置6分钟→各加硝酸铝（1→20） 0.3ml，摇匀，再放置6分钟→各加氢氧化钠试液4ml, 用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟。 在510nm波长下测定各瓶溶液的吸收度（以第一瓶 作空白）以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制 标准曲线。测定样品的浓度。
要使得测定浓度准确 应当考虑影响测定准确的因素： 1 显色反应的完全程度（取决于）： 介质的pH 显色剂的用量 反应温度 反应时间 2 吸光度的物理测定条件
如何确定反应最佳条件
在建立方法时，需要通过实验确定最佳反应 条件，为此改变其中一个因素（例如介质的 pH值暂时固定其他因素，显色后测量相应溶 液的吸光值，通过吸光度-pH曲线确定反应 的酸度范围，其他几个影响因素的适宜值也 可以按这一方法分别确定。
实验六 工作曲线法测定芦丁含量
可见分光光度法
内容
一、分光光度法的特点 二、可见分光光度法与紫外的区别 三、分光光度计测定物质含量的原理 四、工作曲线法测定芦丁含量 五、本次实验注意事项
六、仪器的操作
分光光度法的特点（包括紫外和可见）
分光光度法与其他测定方法比较有这样一些特点 1、首先，它的应用广泛，在国际上发表的有关分析的 论文总数中，分光光度法占28%，我国约占所发表论 文总数的33%。 2、灵敏度高，由于新的显色剂大量合成，并在应用研 究方面取得了重要进展，使得测定物质的灵敏度提高。 3、选择性好，目前有些元素只要控制适当的显色条件 就可以直接进行光度法测定。 4、准确度高，浓度测量的相对误差在1～3%范围 5、分析成本低，操作简便快速。
结果 1、列出浓度C与吸光度A对应表格 2、用作图法绘制芦丁工作标准曲线 3、用计算器回归求标准曲线方程A=(a)C+( b), 要求r=0.998以上 4、从图中读出芦丁的浓度,并计算瓶中芦丁样 品的浓度 5、计算器回归求芦丁样品的浓度并计算瓶中芦 丁样品的浓度。
注意事项
移液管，容量瓶的正确使用 NaOH每吸一次可以放两个，比色杯不要甩 容量瓶易翻倒，注意放好 注意放的时间 NaNO2加0.3ml，不是0.03ml 标准浓度（看黑板），各浓度要计算 蒸馏水要加至刻度后摇(用滴管)，容量瓶拿在手 上看刻度 浓度的测定，以1号为空白，从低浓度至高浓度 来测 数据当场交，报告回去做
芦丁的测定各试剂用量
编号 1 2 1.00 3 2.00 4 3.00 5 4.00 6 5.00 3.00 7
标准溶液(ml) 0 样品溶液(ml)
30%乙醇(ml)
NaNO2(ml) Al(NO3)3(ml) NaOH(ml)
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
2.00
都加0.30ml，摇匀后放置6分钟 都加0.30ml，摇匀后放置6分钟 都加4ml，摇匀后放置15分钟后在510nm条件下测定A
四、思考题 相同厚度的各比色皿透光性不一致时， 为什么要在经过多次洗涤后各皿透光率
差异无改变下才使用校正值？
工作曲线法和标准对比法分别适用何 种情况？从本实验结果看，能否用标准
对比法？
仪器的操作
1、预热： 仪器开机后灯及电子部分需热平衡，故开机预热30 分钟后才能进行测定工作 2、调零： 目的：校正基本读数标尺两端（配合100%T调节）进入正确测 试状态 调整时机：开机预热30分钟后，改变波长或测试一段时间，以 及做高精度测试之前 操作： 将拉杆拉出半格（或打开盖子）遮断光路，然后按 “0%”键，即能自动调整零位 3、调整100%： 目的：校正基本读数标尺两端（配合调零）进入正确测试状态 调整时机：同上 操作： 空白样品置入样品室光路中，盖下盖子（打开光门）然 后按“100%T”键，即能自动调整100%。 4、调波长：用↑、↓箭头调节波长，调至所需波长



可见分光光度法与紫外的区别：
1、光源不同，紫外用氢灯作光源，可见用钨灯 2、测定波长不同，紫外波长范围180～350nm 可见波长范围320～1000 3、可见需显色，紫外不需显色 可见分光光度测定中通常是被测物质与显色剂 反应，生成有色物质，然后测定其吸光度，进而 求得被测物质的含量。
三、实验内容
仪器 光电分光比色计 使用方法见附件 比色皿的校核 将同样厚度的四个比色皿分别编号 标记，都装空白溶液，在所用波长（510nm）下比较 各比色皿的透光率，应相同，若有显著差异，应将比 色皿重新洗涤后再装空白溶液测试，经洗涤可使透光 率的差异减小时，可通过多次洗涤使透光率一致。 若经几次洗，仍然不一致可如下校正：以透光率 最大的比色皿为100%透光，测定其余各皿的透光率， 分别换算成吸收度作为各比色皿的校正值。测定溶液 时，以上述100%透光率的比色皿作空白，用其他各 皿装溶液，测得吸收度值然后碱去所用比色皿的校正 值。

二、实验原理
芦丁又名芸香甙，维生素P，属黄酮类化合物，临床主 要用于治疗脑溢血，高血压，视网膜出血等疾病。 黄酮类化合物的结构性质 结构中含有酚羟基和环酮基结构，可与某些金属盐试 剂生成有色络合物，在510nm波长 处有吸收，用可见分光光度计测 其含量。 本实验利用黄酮甙与亚硝酸钠、 硝酸铝反应在碱性时显红色的 反应测定芦丁的含量。
标准曲线：一份称样量，但是可以定量很 宽的线性范围；中间可能存在的误差---称 样时引入的误差 标准对照法：2份或者2份以上的称样量， 只能定量90-110%的含量，且不能存在较大 的截距
分光光度计测定物质含量的原理： （紫外与可见基本相同）
均采用一个能产生多个波长的光源，通过系列
分光装置后产生特定波长的光源，其透过被测 样品后，部分光源被 吸收，计算样品吸光 值，由比尔-朗白定律

求得样品的浓度。
工作曲线法测定芦丁含量
一、实验目的
（1）掌握可见分光光度计的使用 （2）掌握光电比色的一般操作。 （3）学会用作图法及计算器回归法求 芦丁样品的浓度