分子生物学第六章基因重组
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分子生物学第六章基因重组
一、同源重组
• 功能：减数分裂时染色体分配、DNA修复、特定噬菌体的 复制、酵母的交配型转换、真核基因组的遗传作图、基因 导入
• 模型： 拷贝-选择：在DNA复制中，新生链延伸时转换为新的模板。
如DNA修复。 断裂-重新连接：重组没有在复制中产生，DNA链在双链间
recombination and insertion
3. l-encoded excisionase (XIS): excision of the phage DNA
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分子生物学第六章基因重组
• 整合过程要求在 attp和attB之间进行 识别；而移除过程 则需要在attL和attR 之间进行识别
• 一个链与另一个链 的连接点叫做重组 关节。
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分子生物学第六章基因重组
• 重组关节能沿着 DNA双链分子移动， 这种移动叫做枝状 迁移
• 在一条链被另一条 链取代的过程中， 分叉点可以沿任一 个方向移动
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分子生物学第六章基因重组
• 交差分子旋转 后形成一个平 面结构-----Holliday结构
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分子生物学第六章基因重组
•RecA catalyzes single-strand assimilation
RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.
二、位点专一性重组
• 非序列同源性 • 重组位点特异 • 由识别特异重组位点的酶指导 • 导致DNA序列发生重排
• 举例：
l噬菌体插入细菌基因组 l噬菌体从细菌基因组中切离
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分子生物学第六章基因重组
•Site-specific recombination: ( 位点专一性重组） •bacteriophage l insertion
• 重组过程是可逆的， 但反应条件不同： 整 合 反 应 需 要 int 产 物 和 IHF 因 子 ； 移 除反应还需要噬菌 体xis基因产物。
• xis基因产物决定噬 菌体是否进行复制
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分子生物学第六章基因重组
整合的过程:
A. 具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与 attP和attB位点结合；
三、转座重组
特点：
1.自身携带有转座酶基因，末端有反向重复序列 ;
2.转座过程中出现共联体；
3.转座以后,可以造成原来转座子位置的DNA缺 失(非复制转座)，也可以依然保持在原位，而 在靶序列上复制了一个转座子(复制转座);
• attp发挥作用要240bp，而attB只需要由-11 到+11的23bp的片断即可发挥作用，在这个 片段中，核心两侧只有4bp
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分子生物学第六章基因重组
通路克隆系统 gateway cloning system
• 一种位点特异的DNA重组技术，包括LR和 BP两个反应体系。可简单表示为：
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细菌基国重组中的单链同化作用
single-strand assimilation
• DNA分子的单链部分通过碱基互补配对转移 到另一DNA双链分子中，称为单链吸收或单 链同化。
• 有三个必备条件：
◆
DNA分子必须有单链区
◆
DNA分子必须有自由3’端
◆
内
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分子生物学第六章-基因 重组
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2020/11/10
分子生物学第六章基因重组
遗传重组
• 重组recombination: 是已存在的遗传物质 产生新的组合的过程。
• 分子间或染色体间重组：离散的染色体 混合时产生新的组合。如真核染色体减 数分裂时的染色体独立分配。不依赖酶。
• 分子内或染色体内重组：通过DNA的剪 切和连接产生新的染色体类型。依赖酶。
•How: Holliday model
1. Nicks made near Chi (GCTGGTGG/each 4 kb) sites by a nuclease with recBCD.
2. RecA binds to ssDNA to form RecA-ssDNA.
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分子生物学第六章基因重组
•Haploid prokaryotes •(单倍体生物原核同源重组）
•Between the two homologous DNA duplex (where) • partially duplicated DNA of the chromosome • between chromosomal DNA and “foreign” DNA
• 5. Branch migration & resolving Holliday junction
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•Haploid prokaryotes (原核同源重组）
•Resolving •Holliday junction
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•Haploid prokaryotes •(原核同源重组）
• 3. RecA-ssDNA filaments search the opposite DNA duplex for corresponding sequence (invasion).
• 4. Seal the nicks and form a four-branched Holliday structure
• Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标。
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•RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶，在SSB存在下， 有解开DNA双链的酶活性和ATP酶活性，它在重组中所起 的作用便是提供带有自由3’端的单链DNA。
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• 转座transposition：非同源性依赖。由转座酶、整合酶指 导。酶识别转座因子两端特异序列，但受体位点相对非 特异。
• 不正常重组或非常规重组illegitimate recombination：很少 或不需要同源性。一般使用不正常底物进行细胞正常加 工。与癌症相关。
• 人工重组artificial recombination: 体外进行DNA的剪切和 连接引起的重组，即基因重组。
Chi序列刺激它周围附近的重组
• 与重组有关的基因称为Rec基因
• Rec突变体不能进行同源重组
• 大约10～20个与重组有关的DNA位点通过E. coli 的 Rec基因突变体鉴定
• Chi序列能刺激它周围附近的重组：
•
5’GCTGGTGG 3’
•
3’CGACCACC 5’
• Chi序列在大肠杆菌中每5—10kb出现一次
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• 染色体的重 组包含部分 的物理性的 改变：破损 与再联合
•两条DNA双 链分子的联接 作用是基因重 组的关健环节
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•细线期
•偶线期 •粗线期
•同化作用
分子生物学第六章基因重组
• 同源染色体两对 DNA双链在相应点 产 生 nick ， 一 条 单 链离开它的伙伴， 与另一个双链分子 的相应位置倒易位 置，创造了两个 DNA双链之间的连 系，这种连接在一 起的一对双链叫做 交差分子。
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分子生物学第六章基因重组
•Diploid eukaryotes: crossing over ( 双倍体染色体交换)
1. Homologous chromosomes line up in meiosis (when) 2. The nonsister chromatids exchange equivalent sections (what)
attBXattP
attLXattR
用途：
• PCR产物的定向克隆
• DNA片断高效、广泛的亚克隆
• 氨基或羧基末端的融合蛋白表达
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分子生物学第六章基因重组
LR反应和BP反应
• LR 反应：通路克隆的主要反应,LR 克隆酶(整合酶( Int) 和整合宿主因子( IHF) 蛋白)识别attL 和attR 重组位点后, 催化入口克隆(entry clone) 的外源DNA 及其两端部分位 点取代目标载体(destination vector) 的ccdB 基因及其两 端部分位点(灰色) ,形成表达克隆(expression clone) 。
3’端必须设置在两分子互补区
分子生物学第六章基因重组
RecA催化单链的同化作用
• RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶 段：
◆ RecA在单链DNA上慢慢聚合。
◆
DNA与其互补物在双链上快速配对
反应，产生异源双链连接
◆ 异源双链DNA区带。
，产生一个长的
• SSB(单链结合蛋白)的存在刺激了这个反应
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分子生物学第六章基因重组
• RecA介导的DNA修复
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分子生物学第六章基因重组
重组热点
• 重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期 产生，在联会丝复合物形成阶断消失(~60min)
• 在染色体上容易发生双链破损的位点，称为重 组热点。
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