实验三牛肉膏蛋白胨培养基的制备、微生物的分离与
纯化
实验目的：掌握培养基的配制原则与方法；
掌握划线分离纯化微生物的原理与方法
熟悉手提式高压灭菌器的使用方法和注意事项；
实验材料：器材：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅等。

试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等
实验原理：
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。

培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素、能源和水。

根据微生物的种类和实验目的不同，培养基要选择合适的配比关系；选择合适的理化性质；配后要及时灭菌。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。

由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。

高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法等
实验内容：
1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备
（1）计算根据配方计算出实验中各种药品所需要的量，然后再分别称量。

（2）称量准确称取各种成分。

一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量，然后连同硫酸纸一起放入烧杯中。

（3）溶解向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。

加热搅拌全溶后稍放冷。

（4）调pH值用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH调
至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。

一般比要求的pH高出0.2，
因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。

（5）分装根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-1）。

注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌
污染。

如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高
度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。

（6）包扎试管扎成捆。

试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。

（7）灭菌培养基用0.1Mpa（15lb/in2）高压蒸汽灭菌15~20min，
2.培养基的高压蒸汽灭菌
灭菌原理：水的沸点可随压力的增加而提高，当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时，因锅是密闭的，蒸汽不能溢出，而使压力增加，水的沸点和温度也随之增加。

因此，高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高温，以及热蒸汽的穿透能力来达到灭菌的目的。

一般在0.1Mpa（15lb/in2）的压力时，温度可达121℃只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。

灭菌方法：
(1)加水于灭菌器内到规定的水平面。

(2)需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基），棉塞、
硅胶泡沫塞等用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅
内的套筒中。

摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌
效果。

(3)将灭菌锅盖的排气管插人套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，
切勿漏气。

(4)打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约5~ l0min，
关闭放气阀。

(5)关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压
力和温度都上升，直至压力表指针达到所需压力时，开始计时，通过
调节热源，维持此压力到所需时间。

(6)灭菌完毕，待压力自然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早，否
则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器
以外。

(7)打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。

(8)灭菌锅用完后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。

3.微生物的分离与纯化
借助于划线将混杂的细菌材料逐步稀释，最后在琼脂平板上分散开来，使之出现单一菌落而达到分离纯化的目的。

4. 注意事项
1.要严格按配方配制。

2.调pH不要过头。

3.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。

4. 划线法分离纯化微生物注意各区勿相互交叉。

5. 示教内容：
微生物的分离纯化
高三下册生物书我记得有。

牛肉膏蛋白胨培养基配方：
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。

它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。

其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。

在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。

琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。

琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。

固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏3g
蛋白胨10g
NaCl 5g
琼脂15—20g
水1000ml
pH 7．4—7．6
三、器材
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；
1mol/L NaOH，1mol/L HCl；
试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5．5—9．0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

四、操作步骤
1．称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。

牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。

也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。

另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

2．溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。

最后补足所失的水分。

3．调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。

反之，则用1mol/L HCl进行调节。

注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。

4．过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。

一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。

5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

分装装置见图Ⅴ-1。

分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。

(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，如图Ⅴ-2。

分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

6．加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。

7．包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8．灭菌
将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

9．搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

10．无菌检查
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。