蛋白酶活性测定方法
一蛋白酶活力单位定义
1g 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。

二测定原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。

根据吸光度计算其酶活力。

三应用范围
本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。

四测定条件
4.1 底物：酪蛋白
4.2 pH： 3.00
4.3 温度： 40℃±0.5℃
4.4 保温时间： 10min
五仪器
5.1 紫外分光光度计
5.2 超级恒温水浴40±0.2℃
5.3 秒表
5.4 分析天平：感量0.0001g
六试剂和溶液
6.1.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。

6.1.3 三氯乙酸c(CCI3·COOH)=0.4 mol/L
称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。

6.1.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L
按GB 601配制。

6.1.5 盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L
按GB 601配制。

6.1.6 缓冲溶液
a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。

b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶
甲液称取乳酸(80%～90%)10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取乳酸钠(70%)16 g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。

c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶
甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08 g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000 mL,
上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。

6.1.7 l0 g/L酪素溶液
称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。

此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

注:3 )酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。

6.1.8 l00μg/mL L-酪氨酸4)标准溶液
a. 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，精确至0.0002 g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL酪氨酸标准溶液。

注:4 )L-酪氨酸采用上侮长江生化制药厂产品。

b. 吸取1 mg/mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.l mol/L盐酸定容至100mL，即得到100 μg/mLL-酪氨酸标准溶液。

七分析步骤
7.1标准曲线的绘制（求K值）
按下表1配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算K值，(其K值应在130～135范围内)。

7.2 待测酶液的制备
称取酶粉1～2g，精确至0.0002 g(或吸取液体酶1.00 mL) ，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲液如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。

用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25～0.40范围内)
测定酶粉时稀释倍数参考下表(液体酶亦可参照下表稀释)。

7.3测定
滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10 mm比色皿，测定其吸光度(A)。

7.4 计算
X =A×K×8/2×1/10×n×E
=2/5×A×K×n×E/m
式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
8——反应试剂的总体积，mL；
2——吸取酶液2.00 mL，以1mL计；
1/10——反应时间10 min，以1 min计；
n——稀释倍数；
E——紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77)；
m——试样质量，g。

7.5 结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3%。