摘要动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。

近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。

本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。

关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略目录摘要 (I)1引言 (1)2基础理论概述 (1)2.1细胞培养的概念 (1)2.2原代细胞培养的概念 (1)2.3传代细胞培养 (2)3影响细胞体外培养的因素 (2)3.1细胞分离方法 (2)3.1.1直接分离法 (3)3.1.2酶消化法 (3)3.2细胞培养温度 (3)3.3细胞培养基的成分 (3)3.3.1天然培养基 (3)3.3.2合成培养基 (3)3.4接种密度 (4)3.5培养基的pH值 (4)3.6细胞的冻存与复苏 (4)3.6.1细胞冻存 (4)3.6.2细胞复苏 (5)4细胞实验室无菌环境的防控策略 (5)4.1无菌室的彻底消毒 (5)4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (6)4.2.1清洗 (6)4.2.2消毒灭菌 (6)4.3培养试剂的分装与保存 (7)4.4对操作者的要求 (7)5结语 (8)参考文献 (9)致谢 (10)浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略1引言细胞体外培养技术由于具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测实验结果，以及方便控制培养产物等优点，在医药领域已成为研究发病机理和筛选药物的重要手段，在分子生物学领域，利用细胞培养技术，结合细胞融合、细胞杂交以及转基因技术，进行基因重组、组织构建，成为分子遗传和组织工程研究者的重要研究工具，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分。

近年来，分子生物学和分子遗传学获得巨大进展，培养细胞技术被广泛应用于该领域的研究，这些培养的细胞已成为基因工程、遗传工程、体细胞克隆、转基因动物、生物制药、干细胞、微生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、免疫学等学科研究的有力工具和重要途径。

2基础理论概述2.1细胞培养的概念细胞培养是指将细胞从机体中取出，人工模拟机体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等的研究工作，是维持细胞结构和功能的体外培养方法。

2.2原代细胞培养的概念原代培养是指取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。

培养方法包括：单层细胞培养和悬浮培养。

(1)单层细胞培养：将取下的组织块无菌剪切后，用0.25%胰酶消化，使细胞分离，再用无菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗涤后，置培养皿或培养瓶中培养。

(2)悬浮培养：悬浮培养的细胞多取材于血液或体腔液，一般采用离心法分离细胞，低速500-1000r/min，离心5-10min即可。

培养时，只要取适当浓度的细胞悬液接种于完全培养液中，细胞就能增殖。

2.3传代细胞培养传代细胞培养是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中，即当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养。

根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系或细胞株。

这些细胞一般可顺利传40-50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系／株。

一般细胞原代培养1-4周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖。

在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。

传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。

人传代次数与个体年龄成反比：人胚胎40-60代；幼年20-40代；成年10-30代；得了早老病的儿童2-10代。

传代培养的方式主要有：贴壁型细胞传代和悬浮型细胞传代。

(1)贴壁型细胞传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用ＥＤＴＡ溶液与胰酶按体积比为1:1或1:2比例混合后联合使用。

过滤除菌后小量分装，于-20℃保存。

消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的ＥＤＴＡ溶液与胰酶的混合液，以能覆盖细胞层为宜，将培养瓶平放，37℃作用3-5min，加入Hanks液，1000r/min离心5min即可除去消化液，洗1-2次后加入完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养。

(2)悬浮型细胞传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。

根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积3影响细胞体外培养的因素3.1细胞分离方法细胞分离方法细胞培养之前，首先要进行组织块的分离，其主要方法包括：直接分离法（包括机械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和胶原酶消化）。

3.1.1直接分离法该方法分离得到的细胞数量没有酶消化法得到的多，但可满足一般实验的要求，该方法的优点是操作流程简单，不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶。

3.1.2酶消化法多用于新生动物组织或动物胚胎的肝细胞培养。

胰蛋白酶消化法具有分离效果好、操作简单和价格便宜的特点，因为胰酶消化的条件很难掌握，所以未被广泛应用；胶原酶消化法具有分离效果好、细胞产量高（即时存活率高、对细胞损伤小）、维持细胞特异性功能的时间长等优点。

3.2细胞培养温度不同种类的动物细胞对温度的要求并不一致，如人和哺乳动物的细胞培养温度为35-37℃，鸟类细胞培养温度为38.5℃，鼠类细胞为34℃。

一般来说，细胞对低温的耐受力比高温强。

因此，在细胞的培养过程中要及时地根据细胞的类型调整适宜的温度。

在使用恒温培养箱时，箱内温度应维持在37℃、CO2体积分数为5%。

3.3细胞培养基的成分培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。

培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基，按其来源分为天然培养基和合成培养基。

3.3.1天然培养基最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。

血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。

与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。

质量好的血清应该是无溶血、橘黄色清亮透明、无细菌、无支原体污染的黏稠状液体。

血清的体积分数要控制在5%-20%，当超过30%时反而不利于细胞生长，过高或过低的血清体积分数都不利于细胞的生长和增殖。

一般将血清保存于-20℃以下，时间不易过长。

3.3.2合成培养基合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。

内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。

单独使用细胞虽有生存但不能很好地生长增殖。

迄今为止，人工合成的培养基已有多种，如RPMI-1640、Eagle’s MEM、DMEM等，其主要差别在于氨基酸、维生素、无机盐和能源物质的组成及含量不同。

一般认为RPMI-1640营养全面，对各种组织生长都适用；Eagle’s MEM适合于细胞株的传代培养；DMEM有利于细胞的分裂增殖；Ham’s F12能促进细胞的分化。

也有学者将不同培养基混合应用，从而得到较好的培养效果。

培养液中的抗生素是青霉素和链霉素。

此外，卡那霉素、新霉素、两性霉素、氯霉素等都可以防止细胞培养过程中细菌和真菌的感染。

3.4接种密度一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，细胞密度过大时，养分不足，使细胞迅速老化；而密度过小时，不利于细胞单层的形成。

在传代培养中，细胞的密度取决于传代的时间。

一般分瓶的稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。

在细胞生长的外部条件完全相同的情况下，细胞分散比率不同会导致不同的增殖倍数，影响细胞产量，这对培养种细胞尤其重要。

3.5培养基的pH值在培养动物细胞时，不同种动物或是同一种动物的不同部位对pH值的要求各不相同。

一般认为，动物细胞培养基的pH值一般在7.2-7.4，呈弱碱性。

培养过程中pH值低于6.8时对细胞生长会有抑制作用，细胞生长缓慢；而当pH高于7.6时则细胞不能生长，这可能是由于空气的接触而导致培养基中的营养成分被氧化所致。

3.6细胞的冻存与复苏细胞冻存和复苏的基本原则是“慢冻快融”，实验证明这样可以最大限度地保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质都能提高细胞膜对水的通透性。

缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

3.6.1细胞冻存传代培养的细胞，如果暂时不用，可以冷冻保存。

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞后用于实验。

而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

细胞冻存时向培养基中加入保护剂至终体积分数5％。

15％的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

标准冷冻速度开始为-1℃／min或者-2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。

3.6.2细胞复苏复苏细胞的原则为快速解冻，从液氮中取出细胞冻存管之前应准备好38℃的温水，冻存管取出后用镊子夹住顶端迅速放入温水中，结束后还要在75％酒精中清洗几次，除去透明过程中染上的杂质。

为缩短透明时间，可将标本放在烘干箱或灯光下加热，透明时间长短根据标本大小、多少和环境温度而定。

冻存复苏后的状态主要与冻存保护剂的种类、浓度以及细胞复苏方法和复苏后培养液中小牛血清浓度等有关。

二甲基亚砜（DMSO）是一种具有非常强的溶解能力和非凡渗透能力的化学物质，也是应用最广泛的体外培养细胞冻存保护剂，其常用体积分数为10％～20％，不同种属细胞的最适浓度也存在一定差别。

4细胞实验室无菌环境的防控策略目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染，污染可导致细胞死亡，从而造成人力、财力和时间的损失，有时还可能造成特殊材料的不可再用。

因此，在做细胞实验时，一定要尽力避免污染的发生。

4.1无菌室的彻底消毒无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。