法
大肠杆菌作为受体的特征
• 优点 遗传背景清楚，生长迅速，培养简单， 重组子稳定，载体受体系统完整
• 缺点 结构复杂、长生多种种类的内毒素
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05
目的基因的表达 与筛选
04
受体细胞的增值
目的基因获取
通过dna合成仪用 化学方法合成
表达载体的构建
• • • • •
外源基因在大肠杆菌中高效表达原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
将目的基因导入受体细胞
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 建（人胰岛素原表达法）
基因工程菌的构建战略：
ta c Me t b-
转 化
Ap
r
Gal Me
B t Cpeptide Apeptide peptide
分离纯
M N M
ori
化
C
人胰岛素原的
cDNA
重组人胰岛素
原
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 人胰岛素原表达 建
核糖体结合位点
• 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
• 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’， 即 Shine-Dalgarno （SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基
中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，

大肠杆菌基因工程菌构建
• 包涵体型异源蛋白的表达
• • • • • 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
大肠杆菌工程菌构建
这些构建大肠杆菌工程菌的方法，都是利 用大肠杆菌本身特性，来达到目的基因高效、 稳定、快速表达。
P
终止子
• 终止子选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵 子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终
止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止
作用 终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体
基因组DNA中克隆筛选
生产技术的评价： 在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原 能形成 良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折 叠率高 达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更 为简捷， 而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很 大程度上 弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美 元。目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰 岛素。
表达与筛选
• 对于标定的目的基因的大肠杆菌进行培养 扩增，诱导表达，进而采用多种方法鉴定 筛选 • 一 营养缺陷型筛选 • 二 抗药性筛选 • 三 显色筛选
对于微生物常用蓝白斑法鉴定
大肠杆菌
挑选出转入目的基因的大肠杆菌进行培 养，送到相应部门进行DNA扩增，获取更多 基因。也可以对大肠杆菌进行低温保存处理。
M
化
C
CNBr 处
ori
peptide 化学合成AB链编码序
列 重组人胰岛 素 体外折 叠
理
特异性裂 解
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构
A链B链同时表达法
建
生产技术的评价： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫 键的正 确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工 艺路线生 产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建 立了第 二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
大肠杆菌的基因工程
大肠杆菌基因工程
201220131271 韩武 生物技术一班
一 大肠杆菌表达的优缺点
二 大肠杆菌工程菌的构建策略 三 大肠杆菌工程菌构建，分析，筛选 四 大肠杆菌生产实用重组蛋白
基因工程步骤 01
目的基因的 获取
02
基因表达 载体的构 建
03
将目的基因导入 受体细胞
06
菌种贮存与保护
大肠杆菌基因工程实例
• 胰岛素的合成 • 早期人类从动物体内直接提取，生产效率 低。 • 化学合成 用化学方法合成，成本高 • 基因工程 以大肠杆菌为受体生产胰岛素
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 A链和B链同时表 达法
Ap
r
建
转
化
M
N
ta c
Me
t bGal Me t B Apeptide
分离纯
•
•
第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势
密码子与反密码子相互作用的自由能
•
细胞内tRNA的含量
•
按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并 密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采 用了这种方法
质粒拷贝数
• 将质粒导入大肠杆菌中，在大肠杆菌生长 达到对数期时，质粒会大量拷贝增殖，进 而对大肠杆菌生长以及目的基因表达产生 阻碍。故应将重组质粒控制在可控范围内。
对于大肠杆菌微生物来讲可以用ca+2处理 大肠杆菌，再将目的基因的载体转移到大肠 杆菌中。
启动子
启动子最佳距离的探测
A
E
E
目的基因
A 酶切 E
E 启动 子
开
Bal31酶 解
1
启动子
启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针pko上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT
Prec
A Ptra A Ptrp
T A T G A T
T A A G A C T T G A C A T A T T A C T A T G A C
T A T A A
T A A T G T T A A C T A T A A T A T A A T
Plac Ptac
Ptac = 3 Ptrp A = 11
核糖体结合位点
• 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率， 而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细 胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有 时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
目的基因导入受体细胞
对于微生物大肠杆菌，可以用ca+2处理， 使其达到感受态，感受态细胞可以吸收周围 DNA,进而可将含有目的基因的载体吸附。
目的基因的检测与测定
• 这样得到的大肠杆菌会有四种 • 一 没有转入质粒的大肠杆菌 • 二转入质粒，但质粒上没有外来基因（转 化子） • 三转入进质粒，质粒上有基因但没有目的 基因（重组子） • 四转入质粒，质粒上有目的基因(目的重组 子）
Ap
r
终止密码 子 pKO 1 galK
与质粒上报告基因galk的表达产物联
作用。可将培养基中的半乳糖酵解成 红色素物质 转化galE+、galT+、galK-的大肠杆 菌受体菌株 含有外源启动子活性的 重组克隆
ori
启动子构建
启动子构建
启动子
PlL
-35区序列
T T G A C
-10 区序
G列 A T A C
将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； • 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始 位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； • SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； • 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
密码子
• • • • 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率 并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中， 密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生如链霉菌）基因组中，