动物乳腺生物反应器的研发及应用王幸幸（生命科学系 09生物技术学号：091344025 指导老师：于相丽老师）摘要：文章综述了转基因动物乳腺生物反应器的原理、制备技术及应用、优点、国内外研究进展及存在问题，并对其发展方向进行了展望。

关键词：动物乳腺生物反应器；转基因技术乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，将外源基因导人动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺能够天然、高效合成并分泌蛋白质的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值的蛋白质的转基因动物的总称。

1987年美国科学家Gordon等人首次在小鼠的乳汁中表达出人的蛋白t—PA(组织型纤维蛋白溶酶原激活因子)【1】，展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。

从此，各国进入了对该技术的研发、应用和竞争中。

1 转基因动物乳腺生物反应器的原理乳腺生物反应器(Gland Bioreactor)技术是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体，制作转基因动物，指导外源基因在动物乳腺中特异性、高效率地表达，以期从转基因动物乳汁中源源不断地获得外源活性蛋白。

乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中．经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。

外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区【2】．即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。

2 乳腺生物反应器的制备技术及应用2.1 制备技术制备动物乳腺生物反应器的主要步骤包括：目的基因的选择，重组基因的构建，将重组基因转入受精卵，将转入了外源基因的受精卵植人同期发情的受体动物，对出生后基因整合、表达情况进行检测，对整合、表达的转基因动物进行育种试验，建立由成功转基因个体或群体组建的转基因系等。

上述过程中的重组基因通常含有为目的蛋白编码的序列和一个乳汁蛋白特异性启动子。

有时还要加上另外的调节因子，以促进转基因的高效表达或者不受整合位置影响的表达。

目前已经发现至少有一种特异性蛋白启动子【3】——山羊8一酪蛋白启动子可以启动若干种以coda为基础的构建物的高水平表达而不需要其他调节因子。

转基因技术是制备乳腺生物反应器的核心技术。

目前常用的转基因方法有：显微注射技术、精子介导技术、细胞载体技术、逆转录病毒介导技术等。

各种转基因方法均有其独特的优点和各自的局限性，其中显微注射法是目前最经典可靠、应用最广泛的方法。

2.2 应用2.2.1 建立转基因动物乳腺生物反应器模型目前人类在基因研究上取得了重大进展，特别是2000年6月26日人类基因组草图的绘制完成【4】，新的功能基因被不断发现，但在基因的功能、整合、翻译与修饰、表达调控等方面还存在较多问题，需要达，且对其他的内部组织器官的影响小。

因此转基因动物乳腺生物反应器是研究基因的理想工具，它可以为其它动物生物反应器的研究和商业应用开辟道路。

2.2.2 生产基因工程药物由于乳腺固有的优越性使之成为生产药用蛋白的工厂。

据美国红十字学会和美国遗传学会预测，到2010年所有基因工程药中，利用乳腺生物反应器和营养保健蛋白。

这些蛋白可为免疫系统功能不全的人和接受放、化疗的病人的辅助治疗提供优良制品。

目前通过转基因动物乳腺生物反应器生产的主要生物制品有人乳铁蛋白、人组织型纤溶酶原激活因子(http)、新生血管抑制因子、人血白蛋白等。

2.2.3改变乳汁成分。

提高营养价值利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用乳品的目的是期望获得既能满足蛋白需要又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务。

如导人乳铁蛋白基因以提高乳铁蛋白含量，导人溶酶基因以降低乳中细菌的含量，导人乳糖酶基因降低乳中乳糖含量。

3 转基因动物乳腺生物反应器的优点转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物在伦理学及商品化方向已不存在任何障碍，从乳汁中源源不断的获取具有生物活性的多肽药物和具有特殊营养价值的蛋白已成为一个新兴的转基因制药业，它具有以下优点。

3．1 对转基因动物影响小乳腺生物反应器的目的基因在乳腺中特异的表达，由于乳汁不进人体内循环，故表达的外源蛋白不会影响转基因动物本身的生理代谢过程，对动物内部组织器官影响不大，对动物生活力、繁殖力影响较小。

3．2 生产成本低用乳腺生产同类产品不需要复杂的设备，也不需要高素质操作人员。

产奶量高的动物多为草食动物，饲养成本也比较低。

乳腺生物反应器，从掏建目的基因到繁殖出一头产乳动物，投入约为数千万美元，而建设同样生产规模的生物制药厂．需要1亿美元。

而且一旦转基因动物培育成功．就能通过克隆拄术复制繁殖，进一步降低成本。

有专家估算．用乳腺生物反应器生产1克蛋白质药物的成本，只需0. 02～0. 5美元，用基因工程苗或细胞培养的方法生产，则需800～5000美元，后者是前者成本的1万～4万倍。

生产成本低，售价才有可能下降，广大消费者才用得起【5】。

3．3 产品产量、品质高且易于纯化乳腺生物反应器的产品属纯生物制品，避免了化学、生物毒素污染，安全可靠、品质高。

乳汁中蛋白的种类相对较少，主要是酪蛋白、乳球蛋白、白蛋白和从血液中扩散而来的少量血清蛋白及免疫球蛋白，因此易于分离纯化目的蛋白，且生产工艺简单。

动物乳腺每年产奶量多，因而目的蛋白的表达量多。

用动物乳房生产外源蛋白，目前在初乳中已达到70g／L，在常乳中达到35g／L。

3.4 品种多，市场大，用途广乳腺生物反应器既可用来生产药物，也可以用来生产食品和保健品，其产品和用途主要有【6】：①多肽类药物。

例如，胰岛素、干扰素、促红细胞生成素等。

该产品市场广大，据报道仅在美国待批的多肽类药物就达100多种，今后每年还会增加40多种。

②基因工程疫苗。

如中国农业大学用转基因克隆技术将人的岩藻糖转移酶基因植入牛的基因组内，使牛奶中含有岩藻糖抗原，这种抗原可消除胃溃疡、胃癌等致病源——“幽门螺旋杆菌”③生产抗体。

目前商业抗体因产量小，成本高而仅能用于诊断，利用动物乳腺反应器产业化生产有望使抗体成本降低而用于治疗．④生产酶制剂。

如工业用酶、工具酶等。

⑤生产营养品。

如无乳糖奶，可解决一部分人不能大量饮用牛奶的问题。

又如在牛奶中增加人的转铁蛋白，不仅能抑制有害的肠胃细菌，还能对双歧杆菌等有益细菌起促进作用。

3.5 没有环境污染一个生化制药厂．每年要排出成千万吨的废水、废液和动物内脏，化学试剂和提纯帕药品用舌也台带来一定的污染，还有上千员工『内生活污水和有肌垃墩动物乳腺生物反应器，转基因动物就代替这样一个工厂．j=l要建成一个相当蜕模的养殖场即成，没有环境污染．符台环保要求。

4 动物乳腺生物反应器的研发现状国际上，动物乳腺生物反应器中某些产品的研发比较顺利，从1987年gordon 等人在转基因小鼠乳汁中表达出人的t—pa，之后的20年里，已有数百种产品在小鼠乳腺中获得了高效表达，数种重要医用产品已在大动物乳汁中被生产出来。

如上世纪90年代美英等国从转基因山羊获得的抗凝血酶Ⅲ【7】，从转基因绵羊得到的a—l一抗胰蛋白酶、人凝血因子Ⅸ，从转基因牛获得的乳白蛋白、乳铁蛋白，还有来自转基因兔的一葡萄糖苷酶等。

目前，全球有十几家公司在开展动物乳腺生物反应器的产业化开发。

比如英国的PPL公司、荷兰的Pharming以及美国最大的生物技术公司GenzymeTransgenics Corporation是三个比较出色的公司。

它们在很多药物开发，市场和产业化方面投入了大量资金，到目前，至少已有2种药物完成了临床试验，5种进入临床三期试验，37种进入了二期临床研究阶段。

现在，有十几个国家也在进行相应的工作，像美国、英国、荷兰、加拿大、法国等。

在我国，施履吉院士【8】早在2O世纪80年代初就提出乳腺生物反应器构想，并获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔；20世纪90年代，国家“863”高技术计划将乳腺生物反应器的研究列入重点科研项目；1995年，我国首次在小鼠乳腺中成功地表达了人的基因；1996年，上海医学遗传研究所与复旦大学合作，成功培育出5只转基因羊，并在乳汁中提取出了具有生物活性的人凝血因子IX；“九五”期间，我国首次培育出了高水平表达的转基因绵羊；2001年，又成功获得了5只携带鸡法氏囊疫苗基因的羊，其表达水平基本达到了产业化生产标准； 2005年，国家“863”计划组利用转基因体细胞克隆技术，分别获得了转人乳铁蛋白、转人溶菌酶、转乳清白蛋白、转人岩藻糖转移酶等转入基因蛋白；其中“人乳铁蛋白”和“人一乳清白蛋白”是在国际上首次利用转基因克隆牛而获得。

现在，我国已有4种基因工程药物或疫苗在上海、长春、深圳等地生产并投放市场，另有十余种已进人中试阶段。

5 乳腺生物反应器存在的问题尽管转基因动物乳腺生物反应器技术已经取得了一定成果，展现的广阔的发展潜力和前景，但要广泛应用于生产实际还有诸多理论和技术上的问题需要解决。

5．1 外源基因在动物体内的整合位点问题由于人们尚未完全掌握乳蛋白基因的表达调控规律，目的基因的整合位点及整合详细机理，因此对于导人基因在动物体内的整合位点不能适宜选择，常出现遗传性状不稳定，甚至缺失等问题。

5．2 转基因表达产物的分离纯化问题表达的产物往往是理论含量高而纯化含量低，尽管比发酵工程的目的蛋白纯化要简单，要除去所有可能引起人类变态反应的蛋白和乳中的细菌、病毒等微生物，这些问题仍会给目的蛋白的纯化带来一定困难。

5．3 目的蛋白的翻译后修饰问题转基因动物能够对外源蛋白进行翻译修饰，而动物机体的保护系统对一切外源性物质产生排斥作用，如可能出现的蛋白水解过程，入一羧基化不充分，糖基化形式与人类不同等等【9】。

5．4 转基因的技术与方法问题目前，转基因技术的实验室方法有许多，常用的是显微注射法，且此法已比较成熟，但在反刍兽上成功率较低，只有4 左右，而其他好多方法还在探索阶段。

5．5 乳腺表达药用蛋白安全性问题转基因动物乳腺表达的药用蛋白，基因药用蛋白的纯度、其转运系统及口服药引起的耐受性问题；残留蛋白是否对人体正常功能产生不良影响等，这些问题在现有科学技术水平下无法下结论。

6 展望尽管利用乳腺生物反应器生产目的蛋白遇到许多困难，研究还处在初级阶段，但技术路线是可行的。

如果ESC技术、核移植技术与转基因技术相结合，同源重组能获得目标基因的准确插入，共同整合技术以及转基因胚胎的有效筛选等方面有所突破，那么动物乳腺生物反应器的商业化前景更加广阔。

参考文献：[1] 韩玉剐，李建凡．动物生物反应器的研究现状和进展 [J]．国外畜牧科技，2002，29(1)：30 33．[2] 薛京伦，卢大儒．乳腺生物反应器的研究现状[J]．生物技术通报，1998(3)：17—20．[3]刘森，梁国栋．利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白 [J]．生物工程学报，2000，16(4)：421-424．[4] 曹善东．动物克隆与转基因动物乳腺生物反应器[J]．临沂师范学院学报，2003，25(6)：60-63．[5] 苟克勉，安晓荣．动物乳腺生物反应器的现状和趋势[D]．生物工程学报，2002，18(2)：144-148．[6] 宋雪梅，贾青．乳腺生物反应器的研究进展[J]．黑龙江动物科学与动物医学。