土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。

配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。

待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。

（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。

（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。

要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。

)（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。

值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。

（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。

（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。

2、仪器设备碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。

3、操作步骤;（1）土样前处理新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。

如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。

如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。

将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。

经过预培养的土壤应立即分析。

如需保留，应放置于4℃的冷藏箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24 h。

这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。

土壤饱和持水量按Shaw（1958）的方法测定：在圆型漏斗下端装一带夹子的橡皮管，漏斗内塞玻璃纤维。

取50 g土壤于漏斗中，夹紧橡皮管，加入50 ml水保持30 min。

然后打开夹子，测定30 min内流出的水量。

加入的水量减去流出的水量，再加上原来土壤中含有的水量，即为该土壤的饱和持水量，以烘干土壤质量百分数表示。

（2）熏蒸称取经前处理后相当于20.0 g烘干基重的新鲜土壤(25.0g)3份于50 ml烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓硫酸处理洗涤后烘干的瓷片（0.5 mm大小，防瀑沸），干燥器底部加入少量水以保持湿度。

用土壤熏蒸抽真空装置抽真空，在– MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3～5 min。

关闭真空干燥器阀门，移置25℃黑暗条件下熏蒸24 h。

将熏蒸过的土壤转移到另一个干净的真空干燥器中，反复抽真空（– MPa）6次，每次3 min，彻底除去土壤中的氯仿，直到无氯仿味为止。

否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。

熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为“对照”土壤。

（3）提取@将熏蒸土壤无损地转移到125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml mol L-1K2SO4，土水比为1 : 4（w : v），振荡（25℃，300 r min-1）浸提30 min，用中速定量滤纸过滤于125 ml塑料瓶中。

在熏蒸开始的同时，另称取等量的3份不熏蒸土壤于125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml mol L-1K2SO4同上浸提。

同时做3个不加土壤的试剂空白。

浸提液应立即分析，或在–18℃下保存。

要注意的是低温（–18℃）下保存的土壤浸提液解冻后会出现一些白色沉淀，据推测为CaSO4和K2SO4，对浸提液中有机碳测定没有影响，可不必除去这些白色沉淀（Brookes等，1985），但解冻后也应立即测定，且在取样前应将浸提液彻底混匀。

（4）测定取10 ml土壤提取液于40 ml样品瓶中（注意解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加入10 ml六偏磷酸钠溶液（pH ），使提取液中的沉淀（CaSO4和K2SO4）全部溶解。

采用Phoenix 8000碳–自动分析仪测定样液中的有机碳含量。

先采用2 mm细管向样液中通入高纯度氮气5～10 min，先除去溶解在样液中的部分CO2，样液再进入无机碳排除管进一步排除残留的CO2。

再进入紫外氧化室，在过硫酸钾溶液和磷酸溶液作用下样液中的有机碳全部氧化为CO2，产生的CO2经纯化后再通过红外检测器测定。

详细操作步骤参见仪器使用说明。

标准碳工作曲线：分别吸取0、、、、、ml浓度为1000 mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100 ml容量瓶中，用高纯度去离子水定容。

即得到0、20、40、60、80、100 mg C L-1系列标准碳溶液。

分别吸取上述不同浓度度的标准碳溶液10 ml于40 ml样品瓶中，按上述相同方法测定。

（5）结果计算：.土壤微生物量碳：B C = E C / k EC式中：E C = 熏蒸土壤提取的有机碳–不熏蒸土壤提取的有机碳k EC为转换系数，取值。

二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸－K2SO4提取-流动注射氮分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：同上（2）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：同上（3）硫酸铬钾还原剂：称取50.0 g分析纯硫酸铬钾[KGr?SO4?2]，溶于200 ml分析纯浓硫酸，用蒸馏水稀释到1 L。

？（4）硫酸铜溶液[c（CuSO4）= mol L-1]：称取30.324 g分析纯硫酸铜（CuSO4）溶于蒸馏水并定容至1 L。

（5）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 10 mol L-1]：称取400 g分析纯氢氧化钠溶于蒸馏水并定容至1 L。

（6）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 4 mol L-1]：称取160 g分析纯氢氧化钠溶于双蒸水并定容至1 L，使用前用真空抽滤瓶（膜孔径μm）过滤。

（7）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= mol L-1]：取ml 4 mol L-1 NaOH用去离子水稀释至1 L。

（8）硼酸溶液（ρ（H3BO4）= 2 g 100 ml-1）：称取20.0 g分析纯硼酸（H3BO4）溶于蒸馏水定容至1 L。

（9）硫酸溶液[c（H2SO4）= mol L-1]：取ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ= 1.84 g ml-1）用蒸馏水稀释到1 L，此溶液H2SO4浓度为mol L-1，将该溶液稀释10倍即可得到mol L-1硫酸溶液。

再用mol L-1标准硼砂溶液标定其准确浓度。

（10）标准硼砂溶液[c（Na2B4O7?10H2O）= mol L-1]：先将分析纯硼砂（Na2B4O7 ?10H2O）在55℃蒸馏水中重结晶，过滤后得到的结晶放入装有食糖和氯化钠饱和溶液烧杯的干燥器中（相对湿度70%）干燥。

准确称取经重结晶和干燥的硼砂38.13672 g，溶解于蒸馏水并定容至1 L。

（11）指示剂贮存液：称取1.0 g氨混合指示剂溶解于10 ml mol L-1 NaOH和10 ml 95%乙醇混合液中，用去离子水定容至200 ml。

该贮存液可存放1个月。

~（12）指示剂溶液：取10 ml指示剂贮存液用去离子水稀释并定容至500 ml，用真空抽滤瓶（膜孔径μm）过滤。

注意：此溶液应使用前一天配制，最多可使用1周。

（13）标准氯化铵贮存液[ρ（NH4Cl）= 1000 μg N ml-1]：称取经105℃烘2～3小时的分析纯氯化铵3.8190 g溶于去离子水中并定容至1 L。

此贮存液可稳定保存数月。

（14）标准氯化铵溶液[ρ（NH4Cl）= 50 μg N ml-1]：取10 ml 1000 μg N ml-1氯化铵用去离子水稀释至200 ml。

此溶液最多保存7 d。

2、仪器设备流动注射氮分析仪（FIAStar 5000，丹麦福斯公司）、真空抽滤瓶（膜孔径μm）、容量瓶（100 ml）、其他仪器设备同上。

3、操作步骤\（1）土壤前处理、熏蒸、提取同上。

（2）提取液中硝态氮还原：吸取ml熏蒸与不熏蒸土壤mol L-1 K2SO4浸提液于250 ml消化管中，加入10 ml硫酸铬钾还原剂和300 mg锌粉，至少放置2 h后再消化。

研究结果表明熏蒸与不熏蒸土壤提取液中硝态氮含量差异很小，在测定土壤MB-N时，可以不包括硝态氮，即省略提取液中硝态氮还原过程。

（3）消化：方法Ⅰ：吸取ml熏蒸与不熏蒸土壤mol L-1 K2SO4浸提液（或经还原反应后的浸提液）于250 ml消化管中，加入ml mol L-1 CuSO4溶液、5 ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物（如经浓硫酸处理并洗涤后烘干的瓷片，0.5 cm大小），混合液消化变清后再回流3 h。

（4）消化液中氮测定：消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100 ml容量瓶中，至体积大约为70 ml，待再冷却后慢慢加入10 ml 10 mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀（以免因局部碱浓度过高而引起消化液中NH4+的损失），再用去离子水定容至100 ml。