土壤微生物的分离鉴定及数量测定(一)培养基的制备Ⅰ测定微生物总量培养基:1. 细菌培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)牛肉膏Beefextract 5.0g蛋白胨Peptone 10.0gNaCI 5.0g蒸馏水H20 1000m1琼脂15~20gPH 7.2~7.4制备步骤:⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,加50 mL蒸馏水,置电炉搅拌加热至牛肉膏,蛋白胨完全溶解.⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水,将溶解的牛肉膏,蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2~3次.加入5.0gNaC1,在电炉上边加热边搅拌.⑶加入洗净的琼脂条,继续搅拌,加热至琼脂完全熔化,补足水量至1000 mL.⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值,并用10%NaOH 调至所需pH值,必要时用滤纸或脱脂棉过滤。
一般比要求的pH高出0.2,因为高压蒸汽灭菌后,pH常降低。
⑸根据不同需要,可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。
注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。
如液体培养基,应装试管高度的1/4左右;固体培养基装试管高度的1/5左右;装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。
,塞好棉塞,装入小铁丝筐,然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。
⑹高压蒸汽灭菌,用0.1Mpa(15lb/in2)121℃灭菌(15-20)30min.2. 放线菌培养基(改良高氏1号琼脂培养基)可溶性淀粉20gKNO3 1gK2HPO40.5gMgSO4• 7H2O 0.5gNaCl 0.5g原0.05gFeSO4• 7H2O 0.01gpH 7.2-7.4制备步骤:(1)计算根据配方计算各种药品所需要的量,然后再分别称量。
(2)称量准确称量各种成分。
(3)溶化配制时,先用少量冷水将淀粉调成糊状,倒入少许沸水中,在火上加热,边搅拌边依次逐一溶化其他成分,溶化后,补足水分到1000ml,调PH(可不调)。
(4)分装、包扎、灭菌。
注:各成分按配方顺序依次溶解,对于微量成分,可预先配成高浓度的溶液,方便配置时量的控制。
配制时,先用少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入少于所需水量的沸水中,在火上加热,边搅拌边依次逐一溶化其他成分,溶化后,补足水分到1000ml,调pH。
另:倒平板之前,在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液,每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL(l00ppm)。
3. 真菌培养基(马丁(Martin)-孟加拉红琼脂培养基)葡萄糖10.0gMgSO4.7H2O 0.5g蛋白胨 5.0g孟加拉红33.4mg (或者每升加1%溶液3.3mL)K2HPO41g蒸馏水H20 1000m1PH 自然(4-5)制备步骤:(1)计算根据配方计算各种药品所需要的量,然后再分别称量。
(2)称量和熔化按培养基配方,准确称取各成分,并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中待各成分完全溶化后,边加边搅拌, 以防糊底,补足水分到所需体积。
再将孟加拉红配成1%的溶液,在1000ml培养液中加入1%的孟加拉红溶液3.3ml,混匀后,加入琼脂加热溶化。
(3) 分装、加塞、包扎、灭菌。
(4) 链霉素的加入由于链霉素受热易分解,所以临用时将培养基溶化后待温度降低至45摄氏度左右时才能加入。
注:⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml,或者倒平板之前加链霉素。
⑵倒平板之前加乳酸,每100mL培养基加0.lmL。
Ⅱ测定功能菌所用培养基:1.亚硝酸细菌培养基(改良的斯蒂芬逊(Stephenson)培养基A)(NH4)2SO4 2.0gNaH2PO40.25gMnSO4·4H2O 0.01gMgSO4·7H2O 0.03gK2HPO40.75gCaCO3 5.0g蒸馏水1000mlPH 7.2注:CaCO3最后加,不需要溶解,直接调PH,培养基中有这个成分是为了缓冲pH。
因为硝化细菌的生长会产生酸化效应,使得氢离子过剩,到了一定程度硝化作用将无法继续,所以要碱性物质平衡酸碱。
下同。
2.硝酸细菌培养基(改良的斯蒂芬逊(Stephenson)培养基B)NaH2PO40.25gK2HPO40.75gMgSO4·7H2O 0.03gMnSO4·4H2O 0.01gCaCO3 1.0gNa2CO3 1.0gNaNO2 1.0g蒸馏水1000mlPH 7.23. 反硝化细菌培养基柠檬酸钠 5.0 gKNO3 2.0 gKH2PO4 1.0 g,K2HPO4 1.0 gMgSO4·7H2O 0.2 g蒸馏水1000 mlpH值7.2~7.54.好气性自生固氮菌培养基(改良阿须贝(Ashby)无氮培养基)苯甲酸钠 1.5 gK2HPO4 0.2 gMgSO4·7H2O 0.2 gNaCl 0.2 gCaSO4·2H2O 0.1 gPH 7.4—7.6注:在培养基分装入试管时,每管加入一1cm滤纸长条,要露出液面。
5.氨氧化细菌培养基(蛋白胨氨化培养基)K2HPO4 0.5 gKH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g蛋白胨 5.0 g蒸馏水1000mlPH 7.0~7.26. 好气性纤维素分解菌培养基(依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基)KH2PO4 1.0 gFeCl3·6 H2O 0.1 gMgSO4·7H2O 0.3 gCaCl2·6H2O 0.1 gNaCl 0. 1 gNaNO3 2.5 gpH 7.2~7.4注:在培养基分装入试管时,每管加入一1cm滤纸长条,需露出液面。
(二)试剂的配制1.格里斯试剂(Griess Reagent)第一、第二液:第一液:将0.5g的对氨基苯磺酸(Sulfanilic Acid)溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中,保存于棕色瓶中。
第二液:将0.5gα-萘胺(α-naphthylamine)加入50ml蒸馏水中,煮沸后,缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中,保存于棕色瓶中。
2. 纳氏试剂甲液:将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
乙液:将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。
分别配制甲、乙二液,待冷却后混合,放置2天后使用。
保存于棕色瓶中。
取上清液使用,保存期三周,随着沉淀增加会影响测定结果。
3.二苯胺试剂:溶1.0g无色的二苯胺(Diphenylamine)于20ml蒸馏水中,然后徐徐加入100ml浓硫酸(相对密度1.84)中,保存于棕色瓶中。
(三)实验器材1.仪器设备4℃冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。
2.器材准备⑴将90ml水装入250ml三角瓶中,并装有15-20个玻璃珠,灭菌。
⑵将9ml水装入试管,灭菌。
⑶试管架,1ml无菌吸管,记号笔,白瓷比色板,接种环,酒精灯等。
(四)实验方法1.样品采集在靠近植株根系部, 去除表层0-5cm的表土,采集5-20 cm土壤剖面,多点采集, 混匀后四分法取1 kg, 装无菌塑料袋带回,4℃冰箱保存。
2.悬液制备称取10g土壤样品,放入盛有90ml无菌水的三角瓶中,置于摇床上室温振荡20min,使土样与水充分混合,将土壤中的微生物细胞充分分散,从土壤中分离出来。
此为10-1土壤悬液,吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中,另用无菌吸管吹吸3次混匀,制成10-2土壤悬液。
以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。
3.土壤悬液稀释度选择⑴细菌:10-4~10-6⑵放线菌:10-3~10-5⑶真菌:10-2~10-4以上采用稀释平板法,分别设置三个浓度梯度,二次重复。
⑷亚硝酸细菌:10-3~10-6⑸硝酸细菌:10-3~10-6⑹反硝化细菌:10-4~10-7⑺好气性自生固氮菌:10-3~10-6⑻氨氧化细菌:10-5~10-8⑼好气性纤维素分解菌:10-2~10-5以上采用最大或然法(MPN),分别设置四个浓度梯度,三次重复。
4.接种(平板接种技术)平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种.①斜面菌种接至平板划线法:按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.点接法:一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定.②菌悬液接至平板涂抹法:用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均匀涂布在整个平板上.混菌法:先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至45~50℃的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养.③平板菌种接至斜面此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种.5.培养将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。
培养时间由短到长分别为:⑴真菌:2~3d;⑵细菌:3~4d;⑶放线菌:5~7d。
⑷氨氧化细菌:7~8d;⑸好气性自生固氮菌:7~8d;⑹亚硝酸细菌:10~14d;⑺硝酸细菌:10~14d;⑻反硝化细菌:10~14d;⑼好气性纤维素分解菌:10~14d;6.结果观察⑴亚硝酸细菌:取出培养液5滴于白瓷比色板上,加入格里斯试剂(Griess Reagent)第一、第二液各两滴,如有亚硝酸盐存在,则呈红色。
⑵硝酸细菌:取出培养液5滴于白瓷比色板上,加入格里斯试剂(Griess Reagent)第一、第二液各两滴,如不呈红色,表示亚硝酸均已经完全消失。
此时,另取培养液5滴于白瓷比色板上,加二苯胺试剂2滴,如呈蓝色,则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸,说明有硝酸细菌的存在。
⑶反硝化细菌:加入格利斯亚硝酸试剂,观察颜色变化,确定正负反应。
⑷好气性自生固氮菌:观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成,或有无圆晕混浊出现。