实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。

转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。

42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。

将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。

然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。

[仪器、材料与试剂](一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿(三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。

3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。

[实验步骤]1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。

2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。

以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。

3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。

在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。

注意：1mL的取液器设定在500mL。

悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。

4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。

细胞可以立即使用或储存。

5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。

注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。

转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。

3．冰上放置30分钟。

4．42℃水浴热激60秒。

5．冰上放置2分钟。

6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。

7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。

8．将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上。

9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。

[实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。

计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。

实验二质粒DNA的提取[实验原理]碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0‐12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质‐SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．高压灭菌锅(二)材料1．带有pQE‐31质粒和pUC18‐CAT质粒的两株大肠杆菌2．1.5mL 离心管3．枪头、枪(三)试剂质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)试剂盒的参考配方:Solution I 50mmo1／L 葡萄糖，5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)，1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，Solution II 0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合Solution II I5mo1／L 醋酸钾，60 mL冰乙酸11.5mL 水，28.5mL TE缓冲液，10mmo1／L Tris·HCl1mmo1／L EDTA(pH8.0)，胰RNA酶(RNA酶A)，将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于‐20℃。

[实验步骤](一)提取质粒将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE‐31质粒和pUC18‐CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

以下的操作按试剂盒的说明书进行。

(附试剂盒说明书)(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。

附：试剂盒说明书3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1上海申能博彩生物科技有限公司bbst＠shl63．net www．试剂盒组成：组成K1910（50次）K1920（100次）K1930（250次）Solution I(a) 5m1 10m1 25m1Solution II(b) 10m1 20m1 50mlSolution lll 20m1 50m1 2x50m1Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1TE(d) 5m1 10m1 40m13S Column 50支100支250支Co11ection tube 50支100支250根说明书1份1份l份注：a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。

b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。

c)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。

每次使用后将瓶盖旋紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。

d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。

抽提测序用质粒需要用水洗脱。

主要特点：● 采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。

● 经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。

● 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。

● 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。

实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。

2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。

注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。

3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。

4．加入400ml Solution III，立即上卜颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。

注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。

5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。

无需低温离心。

注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。

6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。

盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟(室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。

注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。

离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。

7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。

8．重复步骤7一次。

9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。

10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。

注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。

测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。

11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或‐20℃保存备用。

lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml 洗实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳[实验原理]DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA 分子量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。

一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。

由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4．高压灭菌锅5．紫外核酸检测仪(二)材料1．pQE‐31和pUC18‐CAT质粒(三)试剂1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)配1000mL 50xTAE：Tris 242 g冰醋酸57 mL0.5mol／L EDTA 200 mLpH 8.02．凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝0.25％蔗糖40％3．琼脂糖4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5µg／mL5．250bp DNA 分子量标准[实验步骤](一)制备琼脂糖凝胶根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。