实验名称：基因克隆
实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、
NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；
操作步骤：
1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，
在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；
2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接
T4lages 1.0
10×T4buffer 2.0
EZ-T 1.0
目的基因8.0
DdH2O 8.0
＿＿＿＿＿＿＿＿＿
20ul
3、取100µl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下
面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；
4、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并
使转化体产生抗药性；
5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，
并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；
6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振
荡培养3h；
7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；
8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充
分混匀，-80℃保存；
实验名称：假病毒的制备
实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试
剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；
操作步骤：
1、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含氨苄（1：1000）的5ml LB 培
养基中过夜培养中，37℃，200r/min；
2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过
程中要注意防污染（在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；
3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ul BamH 1 2.5ul BamH 1 1.0ul
HindIII 2.5ul HindIII 1.0ul
BSA 5.0ul BSA 2.0ul
Buffer2 5.0ul Buffer2 2.0ul
产物20ul PET28-MS2 8.0
H2O 15ul H2O 15ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
50.0 ul20.0ul
37度3小时，
4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外
灯光下暴露太久），用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；
5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接
T4lages 1.0ul
10×T4buffer 2.0ul
PET28-MS2 4.0ul
目的片段8.0ul
DdH2O 6.0ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿
20ul
6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进
行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；
7、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状
态并使转化体产生抗药性；
8、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬
菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；
9、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃
振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；
10、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），
充分混匀，-80℃保存；
11、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含卡那霉素的5ml LB 培养基中
过夜培养，37℃，200r/min；
12、将1ml 过夜培养的菌液接种到100ml 含卡那青霉素的LB 培养基中，37℃，200 r
/min 振荡培养4 -6h 至OD 600值大约在0.6-0.8；
13、加入终浓度为1mmol/L (IPTG)，在37℃条件下，200 r /min诱导表达16h；
14、10,000 rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer 5 ml重悬菌体；<
摇床一小时>
15、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3<5>s，全程
3min，超声12<10>个循环；
16、将破碎完全的表达产物12,000 rpm，4℃，离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清
到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物，分装保存-80℃保存；
17、将得到的病毒样颗粒的双酶消化验证实验分别取4 份用NEB公司的DNaseI、
生工的RNaseA 进行消化37℃消化1h-2h
18、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶消化结果；
19、去第1次消化产物进行第2次消化37℃1h-2h（用NEB公司的DNaseI）
DNaseI 40ul
10×DNaseIBuffer 100ul
消化产物10ul
TE 850ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
1ml
20、DNaseⅠ消化后，加入终浓度为5mM的EDTA终止反应，然后65度10分钟使DNaseⅠ失活；
21、提取RNA标本后上荧光定量，检验病毒颗粒的浓度和质粒的消化情况。