基因克隆的一般流程
PCR RT-PCR 载体 连接 转化 准备感受态细胞 基因的获得
重组子筛选
下游工作
载体的选择

基因工程载体一般要求：
能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细 胞和在细胞中的复制。
应体系中： 加ddH2O使终体积为 15 l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15- 30 ng 10×Ligase Buffer (已含有ATP) 1.5 l T4 DNA Ligase 1.O l 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
易从宿主细胞中分离纯化出来， 便于重组操作。
有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都 能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。

常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等
重组 DNA 技术的一般流程
目的DNA的获得 目的DNA与载体的连接 重组子导入受体细胞 重组子的筛选和鉴定
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建

NGF 基因的克隆(T-A克隆)
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctaga-antisense:
6
5
pEGFP 荧光质粒表达载体
质粒DNA的酶切反应结果
平端连接图示
匹配粘端连接图示
不匹配粘端连接图示
连接反应的建立
连接反应的温度：
粘性末端，按A-T，G-C含量计算，±5℃。 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。 平末端，如EcoRⅤ（GAT↓ATC），可在室温进行，不超过30℃， 酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。
质粒 M 酶切反应 M 酶切反应
pEGFP
pT-NGF
酶切产物凝胶回收操作步骤
（Gel Extraction Kit）
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。 按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分钟， 使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒，倒掉收集 管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液体，再 将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。 将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。 将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1 分钟，9000g×1分钟。备用。


荧光质粒转染观察
DNA量：
摩尔数之比 载体:目的 DNA ＝ 1 : ( 1~3 ) 载体摩尔数 目标DNA摩尔数 目标基因片段碱基数×载体重量 目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
连接反应在灭菌的 0.5ml离心管中进行。 15 l 体积反


重组子的筛选

耐药性基因
外源质粒赋予宿主抗生素抗性 蓝白斑筛选（互补现象） lacZ＋ plasmid 和 M15△ cell strain

关于连接酶
定义：ATP存在下，在3’OH和5’ P之间形成磷酸二酯
键。 特性：连接粘端的效率远高于平端。 1. 首选不匹配粘端 策略： 2. 次选匹配粘端，载体脱磷 3. 平端连接，延长时间，提高酶量
重组子转入受体细胞
体外重组的DNA引入受体细胞
感受态:受体细胞处于易于接受外源 DNA 的状态 原理:（1）遗传物质的传递 （2）受体菌的选择与改造
重组质粒的酶切鉴定
重组子的鉴定

插入片段长度大小鉴定 质粒抽提、酶切；PCR 插入片段方向性鉴定 可以选择基因内部切点进行不对称酶切 DNA序列测定