抗真菌药物筛选模型
励飞小组制作
目录
1.抗真菌药物综述
1.1真菌致病特点 1.2抗真菌药物类型 1.3抗真菌药物作用机制
2.抗真菌药物的筛选方法
2.1传统的筛选方法 2.2定靶的筛选方法
1.抗真菌药物综述
1.1真菌致病特点
顽固性 广泛性 新生性 严重性
1.2抗真菌药物类型
2.2.1真菌细胞壁合成抑制剂筛选
大多数真菌细胞壁成分包括：几丁质，-β葡 聚糖，α-葡聚糖和各种甘露聚糖蛋白。
2.2.1.1 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂
β-1,3葡聚糖是真菌细胞壁的重要成分，但 并不出现在人类和其他哺乳动物细胞。因 此β-1,3葡聚糖的合成被期望成为筛选特异 性抗真菌抗生素的理想靶位。
普纳米星（pradimicin）类和贝娜诺霉素（benanomicin） 类在存在Ca2＋的条件下，其有力羧基与细胞表面甘露聚糖 蛋白质复合物的多糖部分络合，导致细胞壁结构异常而破 裂，细胞膜通透性增加，胞内钾外漏而致细胞死亡。
2.2.1.3 几丁质合成酶抑制剂
几丁质是β-(1,4)糖苷键连接的N-乙酰胺基葡 萄糖(GlcNAc)的链状聚合物，是细胞壁的支 架结构。几丁质合成酶催化GlcNAc在细胞膜 上聚合成几丁质，在真菌细胞的分裂和成 熟中起了重要作用。
几丁质合成酶抑制剂筛选模型
筛选方法类似于甘露聚糖合成酶抑制剂方法。
尼克霉素（nikkomycin）和多氧霉素（polyoxin）是两类几 丁质合成酶抑制剂，因其结构与几丁质的前提尿苷二磷酸 N-乙酰胺基葡萄糖（UDPNlcNAc）类似而竞争性抑制几丁 质合成酶。
2.2.2 真菌细胞膜合成抑制剂
取原液和稀释液两个浓度的孢子悬液，用血球计数仪计数， 结果分别为3.6×106个/ml、3×106个/ml、5.0×106个/ml.
筛选抗真菌活性
① 取无菌平板加底层沙氏培养基20ml，凝固。取制得的单 孢子悬液，将合适的菌液加入48oC保温的100ml沙氏培养 基中轻轻摇匀。再取5ml注入底层培养基上，摇匀制成含 菌平板。待平板凝固后，取4支无菌钢杯按等距离排放， 一个加入酮康唑对照品，另3个加入受试样品，于28oC培 养3d，观察抑菌圈。
文献报道应用这种方法筛选出许多β-1,3葡聚糖合成酶抑制 剂化合物如arborcandins A~F等。
2.2.1.2 甘露聚糖合成酶抑制剂
甘露聚糖是真菌细胞壁组成中三种多糖之 一，对细胞壁的功能起到十分重要的作用。
甘露聚糖合成酶抑制剂筛选模型
分离啤酒酵母的甘露聚糖合成酶，以[14C]GDP-甘露聚糖为 底物。反应混合加入12.5umol/L[14C]GDP-甘露聚糖、 20mmol/L二甲基砷酸盐缓冲液（pH6.5）、10mmol/L MnCl2、1mmol/L二硫苏糖醇、待测样品和甘露聚糖合成酶， 25oC反应30min，使用纸层析测定多聚物。
2.12 纸片法
与管碟法类似，用无菌过滤纸片沾取药物 贴在真菌培养基上，观察菌落情况。
传统方法固然存在许多缺点，但由于操作 简单和处理量大，非常适合微生物发酵样 品初筛。
2.2定靶的筛选方法
目前发现作用于真菌的靶位有三种途径：
① 真菌结构成分及代谢产物分析； ② 真菌产物的生物合成途径及其相关酶分子的研究； ③ 控制真菌生长和细胞分裂的基因序列分析。
化学合成的抗真菌抗生素
如：咪唑类，三唑类
微生物来源的抗真菌真菌药物作用机制
① 作用于真菌细胞膜中醇合成的抗真菌药 物
② 作用于真菌细胞壁合成的抗真菌药物 ③ 作用于核酸合成的抗真菌药物
2.抗真菌药物的筛选方法
2.1传统的筛选方法
选择毒性小的代表性真菌作为试验菌， 采用管碟法或者纸片法测定样品对试验的 抑制或杀伤活性。
检测菌孢子制备
取冻干管中菌接种到沙氏斜面，28oC培养；白色念珠菌培 养24h，表皮癣菌96h，新型隐球菌48h；
然后分别传代，培养至子三代；取孢子长势良好的子斜面 1支加入灭菌生理盐水5ml，用接种环刮下孢子，转移至盛 有玻璃珠的三角瓶。
同样方法处理3次，孢子液合并于三角瓶，轻轻震荡30min， 然后过滤得孢子悬液。
② 取灭菌的300ul沙氏液体培养基，以每孔50ul的量加入到 96孔细胞培养板的个孔中；取50ul样品溶液分别加入到96 孔板的第1行个孔中（从第2列开始留1列作空白对照）， 每1列从第1行开始依次倍半稀释到最后一孔（即第8行）， 然后在 28oC培养16～18h，在倒置显微镜下观察孢子生长 的菌丝形态，判断其活性，计算最小活性浓度。
2.1.1 管碟法
以白色 念珠菌为指示菌，对微生物进行筛 选。
检测菌的培养基：
1. 马铃薯培养基：蔗糖1.5％，马铃薯2.0％，琼脂2.0%,pH 自然；
2. 沙氏培养基：蛋白胨1.0%，氯化钠0.5％，葡萄糖4.0％， 琼脂2.0％，pH自然。
发酵样品处理主要用超声处理，过滤得上 清液，经过无菌过滤。
日本Ohayama建立的筛选模型
提取白色念珠菌和烟曲霉的β-1,3葡聚糖作为反应酶，酶反 应混合物（100ul含）含有 75mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、 0.75mmol/L EDTA、0.75％BSA、1mmol/L UDP-葡萄糖和 0.06uCi的UDP-[U-14C]葡萄糖（519mCi/mmol）。在酶反应 混合物中加入5ul酶溶液，在30oC培养60min，加入100ml冰 冷的20％三氯乙酸溶液终止反应。滤纸过滤获得沉淀物， 先后使用10％的三氯乙酸和95％的乙醇洗涤、风干，加入 100ml的液闪试剂，使用液闪仪测定放射活性。计算酶活 性，筛选时在酶反应混合物中加入测定样品。
真菌细胞膜是一种渗透屏障，可作为小分 子和信号传导的通路。
细胞膜由磷脂类、鞘脂类和固醇类物质组 成，为各种功能蛋白提供基本的骨架。
2.2.2.1麦角固醇生物合成抑制剂
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组分， 在真菌生活中其重要作用。
一些不同类型的化合物通过作用于真菌麦 角甾醇生物合成途径中不同环节的酶，干 扰真菌麦角甾醇生物合成，发挥抗真菌作 用。