Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors
一系列（12或以上）串联重复序列构成识别元件 每个重复有34个氨基酸残基 除12和13位其余都高度保守 重复序列可变的双氨基酸残基(repeat-variable diresidues, RVD) NI-A, HD-C, NNG/A, and NG-T
ZFN mediated genome editing
ZFN的限制性
已建有ZFN库，识别多种DNA序列，但不 能达到识别任意靶DNA，其应用受到限制。 细胞毒性—大量脱靶位点的出现导致基因 组的破坏
构建繁琐—识别特性决定构建难度大，时 间长
Transcription activator like effector nuclease(TALEN)
基因组编辑三大利器
介绍
• ZFN:Zinc-finger nucleases 锌指核糖核酸 酶 • TALENs:transcription activator-like effector nucleases 转录激活因子样效应 物核酸酶 • CRISPR/ Cas9 :clustered regularly interspaced short palindromic repeats 成簇的规律间隔的短回文重复序列/ CRISPR-associated 9
Zinc Finger Nuclease(ZFN)
What is a Zinc Finger?
- 是一种常出现在DNA结合蛋白质中的一种结构基 元。锌螯合在氨基酸链中形成锌的指状结构。 - 对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不 同，可将锌指蛋白主要分为C2H2型、C4型和C6型。 锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA－RNA的序 列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合 在转录和翻译水平上调控基因的表达、细胞分化以 及胚胎发育。
Plant Bacterial TAL Effector
发现：1989年，植物病原体黄担保菌属（Xanthomonas spp.）avrbs3基因 发展：2007年，发现其序列特异性核酸结合特性，avvrBs3-TA. 2009年，TAL effector 氨基酸序列与核酸靶序列的密码被破译、 应用：2011年，Nature Biotechonlogy同时发辫四篇TALEN基因敲除文章和一篇综述
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The principle of TALEN-mediated gene targeting(基本原则)
Ⅰ Ⅱ.利用细胞 HR（同源重 组）修复机 制实现基因 修饰 Ⅱ Ⅲ
Ⅰ.利用TALEN在特 定位点创造DSB
Ⅲ.利用细胞NHEJ （非同源性末端接合） 修复机制实现基因修 饰
TALENs的优缺点
Functional domains of Xanthomonas TAL effectors TAL 效应蛋白的不同结构功能域
N-端包括一个移位子信号 C-端包括一个核定位信号和转录激活域 中间的重复序列决定其特异性 • The number of repeats in TAL effectors varies between 1.5 and 33.5 • The general repeat length is 34 aa
- 结构
• 24-30 个氨基酸残基 •形成α-β-α二级结构 • 两保守的半胱氨酸和组氨酸配位一个锌原子。
Zinc finger nuclease (ZFN)
由一个 DNA 结合域（DNA-binding domain）和一个非特异性核 酸内切酶Fok1构成。DNA 结合域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白 （zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结 合一个特异的三联体碱基。
Genetics, Vol. 188, 773–782
ZFN mediated genome editing
• FOK1二聚体互作 • 与非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组（Homologous Recombination)等方法结合使用 • 同源二聚体或单一ZFN单元的结合造成非特 异性酶切，即脱靶效应（off-target）基因Βιβλιοθήκη 编辑技术基因组编辑技术的介绍
基因组编辑技术是一种可以在基因组 水平上对DNA序列进行改造的遗传 操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切 酶，在预定的基因组位置切断DNA， 切断的DNA在被细胞内的DNA修复 系统修复过程中会产生突变，从而达 到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以 实现三种基因组改造，即基因敲除， 特异突变的引入和定点转基因 基因组编辑是研究基因功能的重要手 段之一，也可被用于人类遗传性疾病 的治疗，因此这类技术成为现代分子 生物学的研究热点
• TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。利用TAL的 序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白， 从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法 不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游 序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基 因操作变得更加简单方便。 • 然而，构建过程中，TALE 分子的模块组装和筛选过程比 较繁杂，需要大量的测序工作。对于普通实验室的可操作 性较低。
Fok I
Structure of the FokI dimer
Origin： bacterium Flavobacterium okeanokoites海床黄杆菌
由一个N-端DNA识别域和C端剪切域组 成
FokI 二聚化才有剪切活性
Tale nucleases (TALENs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain