Plant Bacterial TAL Effector
发现：1989年，植物病原体黄担保菌属（Xanthomonas spp.）avrbs3基因 发展：2007年，发现其序列特异性核酸结合特性，avvrBs3-TA. 2009年，TAL effector 氨基酸序列与核酸靶序列的密码被破译、 应用：2011年，Nature Biotechonlogy同时发辫四篇TALEN基因敲除文章和一篇综述
Genetics, Vol. 188, 773–782
ZFN mediated genome editing
• FOK1二聚体互作 • 与非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组（Homologous Recombination)等方法结合使用 • 同源二聚体或单一ZFN单元的结合造成非特 异性酶切，即脱靶效应（off-target）
CRISPR/Cas9系统的成功应用案例
• 2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISER-Cas systems》一文 中，作者利用CRISER-Cas systems用设计好的DNA莫版替换相应基因 来达到定点修饰 • 2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的《efficient genome editing in zebra fish using a CRISER-Cas system》一文 中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚 胎基因进行修饰 • 2013年2月15日在《science》上发表的《Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems》一文中，作者利用一个包 含两个靶向不同的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑 • 2013年4月12日在《cell stem cell》上发表的《Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs》一文中，作者利用 TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%
基因组编辑技术
基因组编辑技术的介绍
基因组编辑技术是一种可以在基因组 水平上对DNA序列进行改造的遗传 操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切 酶，在预定的基因组位置切断DNA， 切断的DNA在被细胞内的DNA修复 系统修复过程中会产生突变，从而达 到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以 实现三种基因组改造，即基因敲除， 特异突变的引入和定点转基因 基因组编辑是研究基因功能的重要手 段之一，也可被用于人类遗传性疾病 的治疗，因此这类技术成为现代分子 生物学的研究热点
Mechanism of CRISPR/Cas9 to target DNA
蛋白质：核酸聚合物
HNH RuvC
Guide RNA: crRNA（ CRISPR-derived RNA ） 通过碱基配对与 tracrRNA （transactivating crRNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物。通过人工 设计这两种 RNA，可以改造形成具 有引导作用的sgRNA （short guide RNA ） Cas9: 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分， Ruvc结构域剪切未配对的链。
ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9 的比较
均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 发挥作用的机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰
Zinc Finger Nuclease(ZFN)
What is a Zinc Finger?
- 是一种常出现在DNA结合蛋白质中的一种结构基 元。锌螯合在氨基酸链中形成锌的指状结构。 - 对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不 同，可将锌指蛋白主要分为C2H2型、C4型和C6型。 锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA－RNA的序 列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合 在转录和翻译水平上调控基因的表达、细胞分化以 及胚胎发育。
ZFN mediated genome editing
ZFN的限制性
已建有ZFN库，识别多种DNA序列，但不 能达到识别任意靶DNA，其应用受到限制。 细胞毒性—大量脱靶位点的出现导致基因 组的破坏
构建繁琐—识别特性决定构建难度大，时 间长
Transcription activator like effector nuclease(TALEN)
2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入 侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转 移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞 EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同 年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成 双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定 点插入。
CRISPR-Cas系统的结构
CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。
• TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。利用TAL的 序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白， 从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法 不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游 序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基 因操作变得更加简单方便。 • 然而，构建过程中，TALE 分子的模块组装和筛选过程比 较繁杂，需要大量的测序工作。对于普通实验室的可操作 性较低。
- 结构
• 24-30 个氨基酸残基 •形成α-β-α二级结构 • 两保守的半胱氨酸和组氨酸配位一个锌原子。
Zinc finger nuclease (ZFN)
由一个 DNA 结合域（DNA-binding domain）和一个非特异性核 酸内切酶Fok1构成。DNA 结合域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白 （zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结 合一个特异的三联体碱基。
基因组编辑三大利器
介绍
• ZFN:Zinc-finger nucleases 锌指核糖核酸 酶 • TALENs:transcription activator-like effector nucleases 转录激活因子样效应 物核酸酶 • CRISPR/ Cas9 :clustered regularly interspaced short palindromic repeats 成簇的规律间隔的短回文重复序列/ CRISPR-associated 9
CRISPR/Cas9 system
CRISPR-Cas系统简介
CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中， 2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNACRISPR/Cas在基因改造中的应用
• CRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特 异性切割主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别 靶序列上的PAM（ Protospacer-adjacent Motif ）以及protospacer • 发现tracrRNA对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNA的5'端与成熟 的crRNA 3'端有部分序列(约13 bp)能够配对进而形成茎环结构，对维 持crRNA与靶点的配对可能十分重要 根据tracrRNA与crRNA的结构特 性，他们tracrRNA和crRNA表达为一条嵌合的向导RNA (guide RNA， gRNA)，并在体外证明gRNA可以发挥tracrRNA和crRNA的功能 • CRISPR/Cas系统有三类，其中TypeⅡ型系统的核糖核蛋白复合物相对 简单，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一个蛋白 目前，产脓链球菌 (SF370)的TypeⅡ型系统（CRISPR/Cas9）是被改造的最为成功的人工 核酸内切酶，已经在人类细胞 小鼠 斑马鱼中成功实现了基因组定点 修饰。
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The principle of TALEN-mediated gene targeting(基本原则)
Ⅰ Ⅱ.利用细胞 HR（同源重 组）修复机 制实现基因 修饰 Ⅱ Ⅲ
Ⅰ.利用TALEN在特 定位点创造DSB
Ⅲ.利用细胞NHEJ （非同源性末端接合） 修复机制实现基因修 饰
TALENs的优缺点
Functional domains of Xanthomonas TAL effectors TAL 效应蛋白的不同结构功能域