土壤有效磷的测定（Olsen法）
（pH 8.5 0.5molL-1NaHCO3浸提—钼锑抗比色法）
一、实验目的及说明
土壤中有效磷的含量，随土壤类型、气候、施肥水平、灌溉、耕作栽培措施等条件的不同而异。
通过土壤有效磷的测定，有助于了解近期内土壤供应磷的情况，为合理施用磷肥及提高磷肥利用率提供依据。
土壤速效磷的测定中，浸提剂的选择主要是根据土壤的类型和性质测定。
浸提剂是否适用，必须通过田间试验来验证。
浸提剂的种类很多，近20年各国渐趋于使用少数几种浸提剂，以利于测定结果的比较和交流。
我国目前使用最广学的浸提剂是0.5molL-1NaHCO3溶液（Olsen法），测定结果与作物反应有良好的相关性[1]，适用于石灰性土壤、中性土壤及酸性水稻土。
此外还使用0.03molL-1NH4F-0.025molL-1HCl溶液（Black法）为浸提剂，适用于酸性土壤和中性土壤。
同一土壤用不同的方法测得的有效磷含量可以有很大差异，即使用同一浸提剂，而浸提时的土液比、温度、时间、振荡方式和强度等条件的变化，对测定结果也会产生很大的影响。
所以有效磷含量只是一个相对的指标。
只有用同一方法，在严格控制的相同条件下，测得的结果才有相对比较的意义。
在报告有效磷测定的结果时，必须同时说明所使用的测定方法。
二、方法原理
石灰性土壤中磷主要以Ca-P（磷酸钙盐）的形态存在。
中性土壤Ca-P、Al-P（磷酸铝盐）、Fe-P（磷酸铁盐）都占有一定的比例。
0.5molL-1NaHCO3（pH8.5）可以抑制Ca2+的活性，使某些活性更大的与Ca结合的P浸提出来；同时，也可使比较活性的Fe-P和Al-P起水解作用而被浸出。
浸出液中磷的浓度很低，须用灵敏的钼蓝比色法测定，其原理详见土壤全磷的测定章节。
当土样含有机质较多时，会使浸出液颜色变深而影响吸光度，或在显色出现浑浊而干扰测定，此时可在浸提排荡后过滤前，向土壤悬液中加入活性碳脱色，或在分光光度计800nm 波长处测定以消除干扰。
三、实验仪器
研钵、20目筛子、电子天平（0.0001）、振荡器、722分光光度计、振荡器、勺子、小烧杯、容量瓶
四、试剂配制
（1）0.5mol·L-1NaHCO3(pH8.5)浸提剂42.0gNaHCO3（0.5mol 化学纯）溶于约800ml 水中，稀释至1L，用浓NaOH调节至pH8.5（用pH计测定），贮于聚乙稀瓶或玻璃瓶中，用塞塞紧。
该溶液久置因失去CO2而使pH升高，所以如贮存期超过20天，在使用前必须检查并校准pH值。
（2）无磷的活性碳粉和滤纸须做空白试验，证明无磷存在。
如含磷较多，须先用2mol·L-1HCl浸泡过液，用水冲洗多次后再用0.5mol·L-1NaHCO3浸泡过液，在布氏漏斗上抽滤，用水冲洗几次，最后用蒸馏水淋洗三次，烘干备用。
如含磷较少，则直接用0.5mol·L-1 NaHCO3处理。
（3）钼锑抗试剂（6.5mol·L-1[H+]）20.0g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]（分析纯）溶于300ml约60℃的水中，冷却。
另取180ml浓H2SO4（分析纯）慢慢注入约400ml水中，
搅匀，冷却。
然后将稀H 2SO 4液入钼酸铵溶液中，随时搅匀，再加入100ml 0.5% (m/v)酒石酸氧锑钾[K(SbO) C 4H 4O 6·2
1
H 2O]溶液；最后用水稀释至1升，盛于棕色瓶中，此为钼锑贮
备液。
临用前（当天）称取0.50g 抗坏血酸（分析纯）溶于100ml 钼锑贮备液中，此为钼锑抗试剂，在室温下有效期为24h ，在2~8℃冰箱中可贮存7天。
（4）磷标准储备液（Cp = 500g ·L -1） 准确称取45℃烘干4~8h 的KH 2PO 4（分析纯）2.1968g 溶于烧杯中加100ml 水溶解，缓加入5ml 浓H 2SO 4（分析纯），再全部转入1L 容量瓶中，用水定容，该贮备液可长期保存。
（5）磷标准工作液（Cp = 25g ·L -1） 准确吸取磷标准储备液50ml 于1L 容量瓶中，加入30ml 3mol ·L -1H 2SO 4，用水稀释至刻度定容摇匀，此为25磷标准液；用前再准确稀释至2.5g ·L -1,以此液配制磷标准溶液系列。
五、操作步骤 （1）称取风干土样2.00g 置于干燥的250ml 三角瓶中，加入0.5mol ·L -1NaHCO 3浸提剂40ml ，加1平勺无磷活性碳，于往复振荡机上振荡30 1min ，温度设计为25℃。
立即用无磷干滤纸过滤到干燥的50ml 烧杯瓶中。
（2）在浸提土样的当天，吸取滤出液5.00ml 放入干燥的25ml 容量瓶中，加2,4-二硝基酚2~3滴，此时溶液显黄色。
用3或6mol ·L -1H 2SO 4、0.5mol ·L -1H 2SO 4、1mol ·L -1NaOH 调色至刚好无色为止。
再加入2.5ml 钼锑抗显色剂，慢慢摇动，使CO 2逸出。
再加入蒸馏水定容，充分摇匀，显色30min 。
用1cm 光径比色管在700nm 波长处测读吸光度，以空白溶液（5.00ml 0.5mol ·L -1NaHCO 3溶液代替土壤滤出液，同上处理）为参比液，调节分光光度计的零点。
（3）校准曲线 在测定土样的同时，准确吸取2.5g ·L -1磷标准工作溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml ，分别放入25ml 容量瓶中，加水5~10ml, 再加2,4-二硝基酚指示剂2~3滴，用H 2SO 4及NaOH 调节酸度至刚好无色或浅黄色。
再加钼锑抗试剂2.5ml ，定容至刻度，摇匀显色，即得磷标液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg ·L -1。
然后同待测液一样进行比色，绘成标准曲线。
六、结果计算 土壤有效磷（P ），mg ·kg -1 = 显色液Cp *显色液体积*分取倍数/ 土样质量
式中 Cp ——从校准曲求得土壤滤出液中磷的浓度，mg ·L -1P 显色液体积------25ml 注释： （1）用0.5mol ·L -1NaHCO 3浸提—钼锑抗比色法测定结果的评价标准如下：
土壤有效P(mg ·kg -1) < 5 5~10 > 10 土壤有效P 供应标准 低（缺磷） 中等（边缘值） 高（不缺磷）
七、数据处理
绘制标准曲线：
得出公式：y=1.9575x+0.0198
2
组别空白样品1 样品2 样品3 样品4
吸光度0.003 0.031 0.034 0.040 0.037
实际吸光度0 0.028 0.031 0.037 0.034
显色液Cp，mg·L=y=（吸光度-空白）*05031-0.0082
土壤有效磷P，mg·kg-1 = 显色液Cp *显色液体积*分取倍数/ 土样质量
代入数据得显色液Cp，mg·L-1：
样品1：y = 0.075mg/L
样品2：y = 0.080mg/L
样品3：y = 0.092mg/L
样品4：y = 0.086mg/L
各样品土壤有效磷（P）含量为：
样品1 P1 = 0.075 * 25 * （40 / 5）/ 2 mg/㎏=7.46 mg/㎏
样品2 P2 = 0.080 * 25* （40 / 5）/ 2 mg/㎏=8.05mg/㎏
样品3 P3 = 0.092 * 25 * （40 / 5）/ 2 mg/㎏=9.22mg/㎏
样品4 P4 = 0..086 * 25 * （40 / 5）/ 2 mg/㎏=8.64mg/㎏
八、结果分析
（1）从实验的结果来看，四个重复样品的有效磷值相互间有点偏差，造成的原因有多种：第一，有可能是吸取滤出液时取出的量有误差，不完全相等，造成偏差；
第二，有可能是定容50ml时，定容不准确造成偏差；
第三，有可能是测量时润洗比色皿，没有润洗干净，造成偏差；
第四，可能是分光光度计测量不准确，造成的偏差；
但从最终结果来看，d = [|6.70 - 8.05| + |7.90 - 8.05| + |9.10 - 8.05| + |8.50 - 8.05| ] / 4 =0.75
dr = 0.75 / 8.05 * 100% = 9.31%
结果的相对平均偏差较大，因此所测的结果不足以作为土样的有效磷值。
（2）根据用0.5molL-1NaHCO3浸提—钼锑抗比色法测定结果的评价标准，所测得的结果（土壤有效磷）处于5~10mg/Kg之间，因此土壤的有效磷处于中等标准（边缘值）。
假如所测的结果为准确值，则所测的土样的有效磷量少，不利于磷的种植、生长。