海军军医大学博士学位论文基于自噬调控肿瘤相关巨噬细胞表型极化的金纳米粒抗肿瘤机制研究Study on the Mechanism of AuNPs in Anti-tumor Growth Based on Autophagy Regulating Phenotypic Polarization of Tumor-associated Macrophages研究生姓名：学号：指导教师：学科、专业：学位类型：答辩委员会主席：委员：答辩日期：原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，遵照严肃求实的科学精神，独立进行研究工作所取得的成果。
论文中除已注明引用和致谢的内容外，不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。
对论文研究做出贡献的个人或集体，均在论文中作了明确声明并表示了谢意。
本声明的法律责任由本人承担。
论文作者签名：日期：学位论文版权使用授权书本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权湖北科技学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等其他复制手段保存和汇编本学位论文。
保密 ，在_____年解密后适用本授权书。
本论文属于不保密□。
（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：年月日导师签名：年月日目录摘要...................................................................................................... - 1 - Abstract ................................................................................................. - 5 - 缩略词表.............................................................................................. - 11 - 前言.................................................................................................. - 12 - 第一章PEG修饰的金纳米粒的制备、表征和细胞毒性研究....... - 18 -一、仪器与试剂........................................................................... - 18 -二、实验方法............................................................................... - 19 - （一）PEG修饰的金纳米粒的制备.......................................... - 19 - （二）PEG修饰的金纳米粒的表征.......................................... - 19 - （三）PEG修饰的金纳米粒细胞毒性实验.............................. - 20 - 三、结果与讨论........................................................................... - 21 - （一）PEG修饰的金纳米粒的表征.......................................... - 21 - （二）PEG修饰的金纳米粒细胞毒性...................................... - 23 - 四、本章小结............................................................................... - 25 - 第二章金纳米粒体外对肿瘤相关巨噬细胞表型极化的影响....... - 26 -一、仪器与试剂........................................................................... - 27 -二、实验方法............................................................................... - 28 - （一）肿瘤细胞悬液TSN培养巨噬细胞................................. - 28 - （二）金纳米粒对TSN培养条件下的巨噬细胞表型作用的考察-33 -（三）统计学处理....................................................................... - 34 -三、结果与讨论........................................................................... - 34 -（一）TSN培养条件诱导巨噬细胞向M2表型极化............... - 34 - （二）金纳米粒对TSN培养条件下巨噬细胞表型极化作用. - 38 -四、本章小结............................................................................... - 43 - 第三章金纳米粒体内抑制肿瘤相关巨噬细胞表型极化发挥抗肿瘤作用.......................................................................................................... - 44 -一、仪器与试剂........................................................................... - 45 -二、实验方法............................................................................... - 46 -（一）荷瘤小鼠模型的建立、给药和分组............................... - 46 - （二）小鼠肿瘤体积测量........................................................... - 46 - （三）肿瘤组织免疫荧光实验................................................... - 47 - （四）肿瘤组织中巨噬细胞的分离和纯化............................... - 48 - （五）肿瘤相关巨噬细胞表型鉴定流式实验........................... - 50 - （六）肿瘤相关巨噬细胞mRNA的检测（Real-time PCR）. - 50 - （七）统计学处理....................................................................... - 50 -三、结果与讨论........................................................................... - 50 -（一）肿瘤生长曲线及抑制率................................................... - 50 - （二）肿瘤组织中巨噬细胞表型的鉴定................................... - 52 -四、本章小结............................................................................... - 59 -第四章金纳米粒对肿瘤相关巨噬细胞自噬的作用....................... - 60 -一、仪器与试剂........................................................................... - 60 -二、实验方法............................................................................... - 62 - （一）细胞培养和金纳米粒孵育............................................... - 62 - （二）Western检测巨噬细胞自噬相关蛋白的表达................. - 62 - （三）mRFP-GFP-LC3双荧光检测自噬流............................... - 64 - （四）溶酶体酸性测定............................................................... - 65 - （五）吖啶橙(Acridine Orange, AO)测定溶酶体稳定性.......... - 65 - （六）统计学处理....................................................................... - 66 - 三、结果和讨论........................................................................... - 66 - （一）肿瘤相关巨噬细胞自噬相关蛋白的表达变化............... - 66 - （二）mRFP-GFP-LC3双荧光检测肿瘤相关巨噬细胞自噬流水平....................................................................................................... - 67 - （三）肿瘤相关巨噬细胞溶酶体功能的考察........................... - 70 - 四、本章小结............................................................................... - 73 - 第五章调节自噬对肿瘤相关巨噬细胞表型的影响....................... - 74 -一、仪器与试剂........................................................................... - 74 -二、实验方法............................................................................... - 75 - （一）细胞培养........................................................................... - 75 - （二）含mRFP-GFP-LC3质粒的腺病毒转染细胞.................. - 76 -（三）Atg5siRNA转染巨噬细胞.............................................. - 76 - （四）Atg5siRNA转染效果的检测.......................................... - 76 - （五）氯喹（CQ）和雷帕霉素（Rapa）的配制及细胞孵育. - 77 - （六）统计学处理....................................................................... - 78 - 三、结果和讨论........................................................................... - 78 -（一）TSN培养条件下巨噬细胞自噬水平的变化.................. - 78 - （二）自噬抑制剂对TSN培养条件下巨噬细胞M2表型极化的作用............................................................................................... - 80 - （三）自噬诱导剂对TSN培养条件下巨噬细胞M2表型极化的作用............................................................................................... - 85 - 四、本章小结............................................................................... - 86 - 全文总结.............................................................................................. - 87 - 参考文献.............................................................................................. - 89 - 纳米载体靶向肿瘤相关巨噬细胞治疗肿瘤新策略（综述）... - 94 - 在读期间科研成果........................................................................... - 102 - 致谢................................................................................................................................. - 103 -基于自噬调控肿瘤相关巨噬细胞表型极化的金纳米粒抗肿瘤机制研究摘要【研究背景及目的】巨噬细胞（MΦ）在体内受到不同因素的影响可以向两种方向极化：一种是经典途径活化的M1型，能够分泌的IL-12、iNOS和TNFα等炎症因子，发挥抑制和杀伤肿瘤细胞的作用。