饱和脂肪酸浓度达到最大值,在随后的稳定期与衰亡期逐渐减
少。 O2： 去饱和作用需要分子氧, 增加培养基中的氧浓度有助于 提高不饱和脂肪酸含量。 光照强度：对于许多光合成藻类,光照不足将增加ω-6脂肪酸
的合成而抑制ω-3脂肪酸的合成。
五、 微生物油中EPA和DHA的浓缩分离方法
1. 低温结晶法 饱和脂肪酸的凝固点高于不饱和脂肪酸,可利用此特性将
行随机的诱变育种与随机筛选。
1992年Andrew等人发现,由油酸到亚油酸再到γ-亚麻酸、 α-亚麻酸以及其他一系列脂肪酸的脱饱和作用,是由几种不同
的脱饱和酶在起作用。1992年Cohen等人发现有几种吡啶族
的除草剂能抑制脂肪酸脱饱和,SAN9785是ω－3脱饱和的最有
效的抑制剂。如能筛选出抗SAN9785抑制ω－3脱饱和的菌株,
第三节 发酵法制备EPA与DHA 一、 概述 使用微生物大量生产多不饱和脂肪酸 , 比从海水鱼中提取 有明显的优点： 1) 藻油中的EPA比鱼油显示出更大的氧化稳定性,而且没 有鱼腥味
2)
使用基因工程选育菌种有可能大大提高藻类和真菌产
生EPA、DHA和其他多不饱和脂肪酸的潜力。 二、 产生EPA与DHA的微生物
混合脂肪酸中的不饱和脂肪酸分离开。另外,利用脂肪酸在不
同溶剂中的溶解度不同,再结合低温处理,往往会得到更好的分 离效果。但这些方法只能作为EPA和DHA的预浓缩处理。产 物中的EPA浓度可达总脂肪酸的25%－35%。 2. 脂肪酸盐结晶法
碳源： 有葡萄糖、果糖、蔗糖、石蜡等
氮源： 有胺盐、尿素、玉米浆、硝酸盐等 无机盐：有氯化钾、硫酸镁以及铁、锌等离子
工业上一般使用亚硫酸纸浆废液、木材糖化液、废糖蜜、淀 粉工业废液和石油等作为基础发酵液。 菌株大规模培养使用深层培养法。
（三） 微生物油脂的提取
1．菌体油脂提取方法：压榨和溶剂萃取法 2．前处理方法： 1）将干燥菌株与沙一起磨碎 2）稀盐酸处理,将酵母与稀盐酸共煮,细胞分解可得中性脂肪， 得率很高。 3）自溶法,如将酵母在50℃下保温2－3d,自消化后回收脂肪 4）以乙醇或丙酮使结合蛋白质变性,常用的溶剂有乙醚、异丙
isabdllina)、拉曼被孢霉(M.ramanniana)和矮被孢霉(M.nana )进
行了含葡萄糖 60-400g/L 的高浓度碳源发酵培养 ,结果菌株油脂 含量35%－70%,脂肪酸中γ-亚麻酸含量为3%－11%。1987年衰 岛良一等人用雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)发酵生 产γ-亚麻酸,其含量可达18%左右。
2． 生长期 微生物细胞的含油量因培养时间而有显著的差异。 油脂最大收获量的培养条件与细胞油脂最大含量或细胞 最大收获量的培养条件一般不同。
4． 糖浓度和C/N 一般情况下, 培养基中含氮量越高则细胞中蛋白质含量越高
；如果培养基中氮浓度一定，含C越高,油脂积累越多。但碳源
太多渗透压高不利于菌体生长。 下面列举较好的培养条件： ① 毛孢子菌属Trichosporon和内孢菌属Endomyces: 7.5%糖，
2 ． 富 含 油 脂 的 丝 状 真 菌 有 ： 曲 霉 属 (Aspergillus)
(A.ochraceus,Cladosporium fulvum, C.herbarum, Choanphora cucurbitarum)等等，含油量可达菌体干重的25%－65%。
3. 富含油脂的藻类:
螺旋藻（总脂肪含量约7％）、小球藻富含油脂，许多海洋 微藻 及巨藻类中均含有EPA或DHA。能产生DHA的自养性藻种
响。
游离脂肪酸：游离脂肪酸的存在通常会抑制微生物体内其他
脂肪酸的合成。
金属离子： 部分金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2＋等可促进微生 物菌丝体内脂肪酸的合成。 pH：培养基的初始pH保持在6.0～7.6有利于真菌和藻类产
生EPA。
2. 温度、时间、通气量和光照强度 温度: 1） 嗜冷微生物在低于20℃温度下会产生更多的多不饱和脂 肪酸
亚油酸
γ一亚麻酸 α-亚麻酸
10－13
0.2－12 －
12－20
2－3 1－2
65－80
3－15 0.1－0.2
三、 微生物油脂的生产
（一） 发酵条件对油脂生成量的影响 1． 温度 一般情况下微生物油脂生成温度与微生物生长适宜温度一 致,大多数在25－30℃,而低温培养时生成的不饱和脂肪酸含量
增加。
体细胞干粉。这种菌体细胞干粉富含 γ －亚麻酸及亚油酸等 不饱和脂肪酸 ,用超临界C02作萃取剂,将γ－亚麻酸萃取出来 , 就得到不含任何溶剂残余的 γ －亚麻酸油。它不仅产量高、 成本低,而且纯度也超过了从月见草油中提取的γ-亚麻酸。
（二）γ－亚麻酸产生菌
能用于生产含 γ －亚麻酸油脂的微生物属于真菌中的接合 菌 , 包括被孢霉属 (Mortierlla) 、根霉属 (Rhizopus) 、小克银汉曲 霉、枝霉属(Thamidium)和螺旋藻属(Spirulina)的某些菌株。 1985 年 日 本 Osama Suzuki 等 人 对 深 黄 被 孢 霉 (Mortierella
主要集中于涡鞭毛藻纲（Dinophylceae）及prymenesiophyceae
纲,其他则较少,涡鞭毛藻（Dinoflagellates）的特征为总脂肪中 含有极高的DHA（12%－34%）；同时亦含有相当数量的EPA。 4. 细菌油脂: 大多数产油细菌不产甘油三酸酯,而是积累复杂的类脂,如磷 脂、糖脂等。
2）嗜热微生物一般很少产生多不饱和脂肪酸
3）在低温下,能增加蓝绿藻类、细菌、真核藻类、酵母和真 菌菌丝体内不饱和脂肪酸的合成。真菌被孢霉仅在低温 (12 －15℃)下才能产生大量的EPA。
时间：在很多微生物体内,不饱和脂肪酸是随着时间的延长而 减少。一般微生物在对数生长期的末尾或稳定期的开始,多不
三、 微生物体内EPA与DHA的合成途径
多不饱和脂肪酸的合成通常是以单不饱和脂肪酸油酸为
底物,合成中有2个主要的反应：碳链的增长和去饱和作用。 1. 碳链的增长：增加碳链长度是通过引入供体乙酰辅酶A或 丙二酸辅酶A上的2个碳原子。 2. EPA和DHA的合成途径：
油酸(C18:1ω-9) 一2H↓去饱和 亚油酸(18:2ω-6) -2H ↓去饱和 α-亚麻酸 (C18:3ω-3) C2↓增链 二十碳三烯酸(C20:3ω-3) -2H↓去饱和 二十碳四烯酸(C20:4 ω-3) －2H↓去饱和 二十碳五烯酸(C20:5ω-3,EPA) C2↓增链 二十二碳五烯酸(C22:5ω-3) - 2H↓去饱和 二十二碳六烯酸(C22:6ω-3,DHA)
2. 发酵条件 菌种培养温度：28℃－30℃ 通风搅拌培养：通气量为2m3/(m3· min),搅拌速度 400 r/min 发酵时间：4d 发酵培养液参考配方如下: 葡萄糖 10%, (NH4)2S04 0.5%, NaAc 0.3%, KH2P04 0.1%, MgS04· 7H20 0.05%, 酵母膏0.02%和蛋白胨0.01%。
图 微生物体内的EPA与DHA的生物合成途径
四、 微生物合成多不饱和脂肪酸的影晌因素 1. 培养基的组成与pH 氮量：培养基中的氮量会影响绿藻、细菌和真菌生成饱和与
不饱和脂肪酸的比例。增加氮含量, EPA比例增加。
C/N： 对于异养微生物(如真菌),氮和碳含量都影响着脂质的产 生。高C/N比将增加拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)生成物 中多不饱和脂肪酸的含量。 氮源：不同氮源对微生物体内多不饱和脂肪酸的积累也有影
利用螺旋藻生产γ－亚麻酸还需从以下3个方面 来研究 提高其产量: (1) 寻找合适的培养条件; (2) 设计合理的培养系统; (3) 选育高产γ－亚麻酸的菌株 由于一般野生菌株γ-亚麻酸的含量较低,所以常需通过育 种以得到γ-亚麻酸高产变异菌株。目前对菌株γ－亚麻酸的产
生与调控机制还不很清楚,只能采取传统的物理或化学方法进
在发酵培养前期菌种主要利用源为主,菌体细胞分裂程度剧烈上升,进入对 数生长期,同时菌体细胞内油脂蓄积增加。
（四）油脂抽提 由于油滴存在于菌体细胞内,需采用球磨机或高压匀浆机 将菌体细胞进行机械破碎。 充分研磨后的破碎菌体干燥后可用CO2超临界萃取γ－ 亚麻酸或先后用乙醇和正己烷分步抽提油脂,也可用氯仿与 甲醇按2:1的体积比的混合溶剂抽提油脂。
0.0233%氮。
② 镰刀菌属Fusarium: 13%糖, 0.11%蛋白胨。
③ 红酵母Rhdotorula gracilis: 100g糖, 0.5g氮。
5． 通风量
油脂是由基质的糖类还原而生成 ,微生物细胞的增殖也需 要大量的氧,因此在深层培养中通入一定的风量是必要的。 6． 矿物元素 矿物元素对各种菌株的影响不同 一般来说,在比生长适当浓度稍高的矿物元素浓度下油脂 会蓄积,但太高时就被阻止。 （二） 微生物油脂生产的原料
就有可能形成γ－亚麻酸的高产菌株。用此法测出抗SAN9785
菌株的γ－亚麻酸含量由21.19%提高到23.6%,脂肪酸含量由
4.09%提高到6.07%。
（三） 生产工艺要求 1. 菌种要求
对用于工业化生产γ－亚麻酸油脂的菌种要求是:
1）单位培养液的菌体得率高(大于20%)； 2）油脂含量接近或超过一般的油料植物(25%－50%)； 3）油脂中γ－亚麻酸含量高(5%－15%)； 4）适应在高浓度培养基中的发酵培养以达到菌体产量 大、发酵罐利用率高的要求。
二 、 微生物油脂的组成
表 微生物油脂、母乳脂肪和月见草油的脂肪酸组成比较 脂肪酸(%) 肉豆蔻酸 棕榈酸 棕榈油酸 硬脂酸 油酸 微生物油脂 母乳脂肪 月见草油 0.6－0.8 25－28 1－2.5 4－10 40－50 4－11 20－25 3－5 5－7 26－30 0.1－0.2 5－0 0.1－0.2 1.5－3.5 6－11