三 动 物 细 胞 培 养 过 程
动) 分解弹性纤维)
单个细胞
加特殊培养液 特殊培养液 如:动物血清等
细胞悬浮液
原代培养
①细胞密度过大,代谢消耗引起营养枯竭 细胞密度过大, ②细胞贴壁生长和细胞的接触抑制
细胞形成生长晕并增大
传代培养
细胞系或细胞株
杂交瘤细胞(多种) 杂交瘤细胞(多种) 细胞培养
选出能产生特定抗体 选出能产生特定抗体 的细胞群培养 体外培养 体内培养
从培养液中提 取单克隆抗体
从小鼠腹水中 提取单克隆抗体
思考: 思考:
1,为何要进行两次筛选? 第1次筛选得到杂交瘤细胞 (多种). 第2次筛选得到能产生特异 性抗体的细胞群. 2,如何进行第2次筛选? ,如何进行第2 培养在多孔细胞培养板上, 每孔只有一个杂交瘤细胞. (3)单克隆抗体的优点 P33 )单克隆抗体的优点: 特异性强,灵敏度高. 特异性强,灵敏度高.
诱导方法 用途
2.动物细胞融合的成功应用 动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备 思考: 思考:
人们获得抗体的传统方法是?
–将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体
这种方法的缺点是什么?
–效率低,产量有限,纯度低,动物抗体注入人体可能产生 严重的过敏反应.
(1)单克隆抗体 )
5,提高细胞克隆形成率的措施 6,细胞克隆的用途
二,动物的细胞融合技术及其应用 1.动物细胞融合 动物细胞融合
(1)定义 ) 用自然或人工方法,使两个或多个不 同的细胞或不同基因型融合成一个 细胞的过程. (2)诱导融合的因素 ) 生物法:灭活的仙台病毒诱导融合 化学法:聚乙二醇诱导融合 物理法:电激,激光诱导融合 细胞融合, 细胞融合,形成杂种细胞 细胞膜连接 病毒颗粒黏 附细胞表面
(2)单抗的制备过程 )
1. 动物免疫 2. 分离B淋巴细胞 3. 细胞融合——淋巴 细胞杂交瘤的制备 4. 杂交瘤细胞的筛选 5. 单克隆抗体的制备 和冻存 6. 单克隆抗体的纯化
(2)单抗的制备过程 )
从经抗原免疫的小 鼠中分离B淋巴细胞 鼠中分离 淋巴细胞 骨髓瘤细胞
细胞融合, 细胞融合,筛选
2.动物难以克隆的原因 动物难以克隆的原因
动物的基因组中,一类基因是维持生存的, 动物的基因组中,一类基因是维持生存的,在各种细 胞中都处于活动的状态. 胞中都处于活动的状态.另一类基因随着组织器官和发育 阶段不同而选择性表达. 阶段不同而选择性表达. 动物的体细胞已发生分化,基因组中基因的活动很不完全, 动物的体细胞已发生分化,基因组中基因的活动很不完全, 不能像受精卵那样发挥细胞的全能性
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能 将能够产生特定抗体的 淋巴细胞和具有无限增殖能 淋巴细胞 骨髓瘤细胞融合在一起 力的骨髓瘤细胞融合在一起,形成杂交瘤细胞. 力的骨髓瘤细胞融合在一起,形成杂交瘤细胞. 杂交瘤细胞既能在体外快速生长, 杂交瘤细胞既能在体外快速生长,又能持续分泌成分 单一的特异性抗体. 单一的特异性抗体. 这种单一类型的只针对某一特定抗原的抗体分子 单一类型的只针对某一特定抗原的抗体分子, 这种单一类型的只针对某一特定抗原的抗体分子,就 是单克隆抗体. 单克隆抗体.
2.克隆羊培育过程 克隆羊培育过程
黑面绵羊去 核卵细胞 白面绵羊乳 腺细胞核 细胞核移植 重组细胞 电脉冲刺激 早期胚胎 胚胎移植 另一头绵羊的子宫 妊娠, 妊娠,出生 克隆羊多利
讨论(阅读 讨论(阅读P36) )
1.体细胞羊的克隆成功证明了什么? 体细胞羊的克隆成功证明了什么? 体细胞羊的克隆成功证明了什么
细胞膜被 病毒颗粒穿通
(3)植物体细胞融合和动物细胞融合的比较 )
比较项目 细胞融合原理 细胞融合的方法 植物体细胞融合
细胞膜的流动性 去除细胞壁后诱导 原生质体融合 电刺激 化学(聚乙二醇) 化学(聚乙二醇) 获得杂种植株
动物细胞融合
细胞膜的流动性 使细胞分散后 诱导细胞融合 电融合,PEG, 电融合,PEG, 灭活的仙台病毒 制备单克隆抗体
动物细胞培养条件: 动物细胞培养条件:
无菌,无毒环境 适宜的温度—人和哺乳动物细胞最适温度为35 -37℃. 气体和适宜的酸碱度—需要一定量的O2等, pH7.2-7.4 适宜的渗透压 营养物质——
主要有:葡萄糖,氨基酸,无机盐, 主要有:葡萄糖,氨基酸,无机盐, 主要有 维生素和动物血清等 维生素和动物血清等 动物血清 保证细胞顺利的生长增殖
(四)细胞系和细胞株
1.细胞系: 可连续传代的细胞 细胞系: 细胞系
(1)有限细胞系: )有限细胞系: 不能连续培养下去的细胞系. 不能连续培养下去的细胞系.如:二倍体细胞 (2)连续细胞系 )连续细胞系: 能连续培养下去的细胞系 大多数具有异倍体核型
有的是恶性细胞系,具有异体致瘤性 有的是恶性细胞系,具有异体致瘤性; 有的获得不死性(保留接触抑制,不致癌) 有的获得不死性(保留接触抑制,不致癌)
(三)动物细胞培养过程
材料动物有何特点,为什么? 材料动物有何特点,为什么? 一般为幼龄动物或胚胎, 一般为幼龄动物或胚胎,因为这些组织或 器官上的细胞生命力旺盛, 器官上的细胞生命力旺盛,分裂能力强 用胰蛋白酶处理目的? 用胰蛋白酶处理目的? 消化组织中的胶原纤维和细胞外的其他 成分,获得单个的成纤维细胞悬浮液. 成分,获得单个的成纤维细胞悬浮液. 思考动物培养条件?特殊培养液? 思考动物培养条件?特殊培养液? 此处细胞在该生活环境中能无限生长和 增殖吗? 增殖吗?
1885年鸡神经板在生理盐水中培养成活组织培养一词诞生 年鸡神经板在生理盐水中培养成活组织培养一词诞生 萌芽 1903年 皮肤及白细胞培养于腹水和血清中,结果细胞的成活期达 年 皮肤及白细胞培养于腹水和血清中, 1个月,并且看到细胞分裂 个月, 个月 真正开始 1907美国科学家将一部分蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中,成 美国科学家将一部分蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中, 美国科学家将一部分蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中 功看到了神经纤维末端的阿米巴运动, 功看到了神经纤维末端的阿米巴运动,解决了神经纤维起源 问题,并创立了悬浮培养法 问题,并创立了悬浮培养法 1912年鸡胚细胞的培养 年鸡胚细胞的培养1943科学家在致癌物 甲基胆蒽的要倒 科学家在致癌物20-甲基胆蒽的要倒 年鸡胚细胞的培养 科学家在致癌物 下培养小鼠结缔组织,获得了能在小鼠体内生长肉瘤的L-细胞系 下培养小鼠结缔组织,获得了能在小鼠体内生长肉瘤的 细胞系 1951通过对黑人妇女的宫颈癌组织的体外连续培养,获得肿 通过对黑人妇女的宫颈癌组织的体外连续培养, 通过对黑人妇女的宫颈癌组织的体外连续培养 瘤细胞系即不死细胞系 不死细胞系-海拉细胞系 瘤细胞系即不死细胞系 海拉细胞系 组织培养工作进入了全新阶段
思考: 思考:植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 原理 培养基性质 培养基特有成分 培养结果 培养目的 植物组织培养
细胞的全能性 固体培养基 蔗糖 植物激素 植物体 培育植株等
动物细胞培养
细胞增殖 液体培养基 葡萄糖 动物血清 细胞株, 细胞株,细胞系 获得细胞或细胞分 泌蛋白
(五)克隆培养法
3.动物核移植实验和克隆繁殖 动物核移植实验和克隆繁殖
(1)核移植:利用供体核来取代另一个细胞中的细胞核. )核移植:利用供体核来取代另一个细胞中的细胞核.
去 核
注 核
受精卵去核 早期胚胎植入同步孕鼠 子宫中
注入囊胚细胞 团的细胞核
重组细胞
实践证明: 实践证明:胚胎细胞核的移植 成功率远高于成体细胞. 成功率远高于成体细胞.
(1)高度分化细胞经过一定技术处理,也可回复到 )高度分化细胞经过一定技术处理, 类似受精卵时期的功能 ( 2)在胚胎和个体发育中,细胞质具有调控细胞核发 )在胚胎和个体发育中, 育的的作用. 育的的作用.
2.为什么克隆羊能获得成功,请用分子细胞学机理 为什么克隆羊能获得成功, 为什么克隆羊能获得成功 来阐述原因. 来阐述原因. 3.克隆动植物具有哪些应用? 克隆动植物具有哪些应用? 克隆动植物具有哪些应用
解释1:需要定期转移,分装培养原因? 解释 :需要定期转移,分装培养原因? 细胞贴壁
(1)细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭. )细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭. 细胞的接触抑制: (2)细胞贴壁生长和细胞的接触抑制: )细胞贴壁生长和细胞的接触抑制 贴壁生长:细胞培养时,悬液中分散的细胞很快就贴附在 贴壁生长:细胞培养时, 瓶壁上. 瓶壁上. 要求:培养瓶或培养皿的内表面光滑,无毒,易于贴附. 要求:培养瓶或培养皿的内表面光滑,无毒,易于贴附. 接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞 接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时, 接触抑制 就会停止分裂增殖的现象. 就会停止分裂增殖的现象. 解 原代培养: 从机体取出后立即进行的细胞,组织培养, 原代培养: 从机体取出后立即进行的细胞,组织培养, 释 到培养的细胞形成生长晕并增大为止. 到培养的细胞形成生长晕并增大为止. 2: : 传代培养: 传代培养: 细 将原代培养细胞分成若干份, 将原代培养细胞分成若干份,接种到若干份培养 胞 基中,使其继续生长,增值. 基中,使其继续生长,增值. 培 养 即:细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养 瓶为传代培养. 瓶为传代培养.
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1,定义: 定义: 2,产物: 遗传性状均一,表现的性状相似 产物: 遗传性状均一,
未经克隆的异质性细胞系
克隆
纯系
3,细胞克隆的基本要求: 来源于单个细胞 细胞克隆的基本要求:
选择对培养环境具有较大适应范围 较大适应范围和 4,克隆对象的选择 选择对培养环境具有较大适应范围和 具有较强独立生存能力的细胞. 具有较强独立生存能力的细胞. 较强独立生存能力的细胞 单细胞不如群体细胞 原代培养细胞和有限细胞系不如无限细胞系,转化细胞系和 原代培养细胞和有限细胞系不如无限细胞系, 肿瘤细胞