3.Caspase
Caspase (cysteine-containng aspartatespecific protease)：一组活性中心富含半胱 氨酸，对底物的天冬氨酸有特异水解作用 的蛋白酶。
目前已发现该蛋白酶家族至少有13个成员， 水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体， 形成凋亡小体。
按照结构同源性
Gene-specific primer
荧光显微镜
Hoechst33258染色法 Hoechst33342染色法 DAPI PI/Hoechst33258染色法 PI/ Annexin V-FITC染色法
荧光染色
DAPI
DAN ladder
流式
PI/Hoechst33258染色法 PI/ Annexin V-FITC染色法
B 细胞淋巴瘤/白血病-2，B cell lymphoma/leukemia-2
分布：造血细胞，上皮细胞，淋巴细胞等多 种瘤细胞
抗凋亡机制： •直接抗氧化 •抑制线粒体释放促凋亡蛋白质 •抑制凋亡调节蛋白对细胞的毒作用 •抑制凋亡蛋白酶的激活
1. bcl-2基因
Tsujimoto于1984年从伴有4(14,18)染色体易位 的滤泡状B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma)中发现。
胞核和胞质 经常出芽和 碎裂成一些 有膜包被， 内涵物不外 溢的小块， 即凋亡小体
（apoptotic bodies)。
二、细胞凋亡的基因调控
凋亡相关基因
•抑制凋亡基因：Bcl-2 •促进凋亡基因：P53 •双向调控基因：c-myc，Bcl-x
双向调控基因
C-myc
C-myc是一种癌基因，是调控细胞周期的主要基因。 编码的蛋白是DNA结合蛋白，调控基因转录，主要激
二、 抗代谢药 (antimetabolites)
（一）二氢叶酸还原酶抑制剂
甲氨蝶呤 methotrexate
（二）嘧啶核苷酸合成抑制剂
氟尿嘧啶 fluorouracil
替加氟 tegafur
(三）嘌呤核苷酸合成抑制剂 巯嘌呤 mercaptopurine 硫鸟嘌呤 thioguanine 磺巯嘌呤 sulfomercaprinesodiumsodium 喷司他丁 pentostatin
的大小，可以将 caspase蛋白酶分 为三个组，分别 以caspase-1、 caspase-2和 caspase-3为代表。 其中最重要的是 caspase-1、 caspase-3 和 caspase-8。
Caspase -1(ICE)
ICE即IL-1b 转化酶(IL-1b converting enzyme)，是 单核细胞合成的一种蛋白酶，可以将34kD的IL-1b 前体(pro-IL-1b )剪切为17kD的成熟IL-1b ，这种剪 切对于IL-1b 活性的发挥是必须的。
三、细胞凋亡的测定方法
形态学观察
电镜
细胞活力测定
MTT MTS(细胞分选)
Annexin V-FITC /PI
凋亡因子的测定
1蛋白 2基因
蛋白
Western-blotting 流式细胞仪测定
Bcl-2 Bax β-tublin
26KD 23KD 55KD
基因
PCR
Real-time RT -PCR
ICE基因定位于11q13-23，编码的ICE前体(proICE)全长404aa，约45kD，蛋白酶活性中心是位于 283~287位置的Gln-Ala-Cys-Arg-Gly (QACRG)五 肽序列，其中Cys285是发挥酶切活性的关键残基。
Caspase -3
pro-caspase-3含有277个氨基酸残基，分子量约32kD， 与ICE有30%同源性，与CED-3有35%同源，是 caspase家族中与CED-3同源性最高的，不论从结构 同源性还是从底物特异性来看都与CED-3很相似， 所以有人认为它是CED-3在哺乳动物中的同源蛋白。
活介导细胞增殖的基因；反之也激活凋亡基因。
Bcl-x
是1933年发现的一类与Bcl-2相关基因。 Bcl-xl— 抑制细胞凋亡。 Bcl-xs— 促进细胞凋亡。
促进凋亡基因 P53基因
P53
修复受损的DNA，如修复失败则诱导细胞凋亡 如果突变,则使DNA异常复制不能停止,促癌发生.
抑制凋亡基因
Bcl-2
（四）核苷酸还原酶抑制剂 羟基脲 hydroxyurea （五） DNA 多聚酶抑制剂 阿糖胞苷 cytarabine , Ara-C 安西他滨 ancitabine
（一）叶酸拮抗药 甲氨蝶呤 Methotrexate
bcl-2大约长23kb，含3个外显子和2个内含子， 编码1个26 kd的膜蛋白。
Bcl-2蛋白存在于线粒 体内膜、核膜和内质 网膜。
抗氧化剂，抑制过氧 化物诱导的凋亡。
延长细胞的生存期， 对细胞的增值率无影 响。
Bcl-2家族包括Bcl-2、Bcl-XL、 Bax 、Bcl-xs、 Bad、Ced-9等。
2.c-myc基因
c-myc的表达产物 Myc是一种DNA结 合蛋白。其促凋亡 活性区、促转化区 和自身调节生和细胞凋亡 的共同信号。
c-myc ↑（生长因子存在）→ 细胞增值
c-myc ↑（生长因子不存在）→ 细胞凋亡
c-myc × （生长因子不存在）→ 生长抑制
• 新生血管生成抑制药（Avastin，04-02-26） • 肿瘤耐药性逆转药 • 纳米药物（抗体包衣、高分子包裹、磁性）
二、 抗肿瘤药物的分类及有关特性
（一） 抗恶性肿瘤药物分类
1 烷化剂 2 抗代谢药 3 抗肿瘤抗生素 4 铂类配合物 5 植物来源的抗肿瘤药物 6 影响激素功能的抗癌药物 7 其他抗肿瘤药物 图 46-3抗肿瘤药物的主要作用机制
作用环节
• 2干. 生扰核物酸化生学物角合成 度
• 直接影响DNA结构与功 能 • 干扰转录过程和阻止 RNA合成 • 干扰蛋白质合成与功能
• 调节激素平衡
（二）耐药性 （resistanceresistance）
多药耐药性（ 多药耐药性 （multidrugresistance, MDR）：
caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶 PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，该酶与DNA修 复、基因完整性监护有关。
Caspase -8
Caspase-8前体共 有479aa，分子 量为55kD 。 Caspase-8可以在 凋亡过程中间接 与细胞膜受体发 生联系，从而将 细胞膜事件转化 为细胞浆事件。
• 其他分类及代表药
甲烷磺酸酯类 白消安 (busulfan; 马利兰, myleran)：慢粒、原发性血 小板增多症、真性红细胞增多症；久用可致肺纤维化（马利兰肺）、闭经、 睾丸萎缩。 亚硝脲类 卡莫司汀 (carmustine)、洛莫司汀 (lomustine)、司莫司汀 (semustine)：脂溶性高，易透过BBB；脑瘤、黑色素瘤、胃肠道肿瘤。
恶性肿瘤的传统治疗方法
• 手术 • 放疗 • 化疗（药物治疗） • 中医治疗
化疗适应证
1 造血系统恶性肿瘤：白血病、多发性骨髓瘤、 恶性淋巴瘤 2 某些化疗效果好的实体瘤：皮肤癌、绒癌、恶性葡萄胎、
睾丸癌、小细胞肺癌 3 实体瘤术后或放疗后的巩固治疗，或有复发和播散者 4 实体瘤已有广泛转移，不适于手术或放疗者
Bcl-2 β-actin
250bp 500bp
Extracted total RNA
Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay was carried out to analyze the mRNA level of Bcl-2. Total RNA was extracted using the RNAeasy kit according to the manufacturer’s instructions (Bioecon Biotec Co. Ltd. China). The purity of RNA was checked by OD260/280 of RNA samples (>1.8). cDNA was synthesized through reverse transcription using M-MLV Reverse Transcriptase and Oligo (dT) primer.
第四十六章 抗恶性肿瘤 药物
Antineoplastic Drugs
第一节 概 述
恶性肿瘤的概念
•机体自身细胞变得不受控制的 增殖和扩散的疾病
二、作用机制
1. 细胞生物学角度 肿瘤细胞的共同特点：增殖基因被开启或激活
分化基因被关闭或抑制无限增殖状态 机制：抑制增殖；诱导分化；诱导死（凋）亡
(从细胞分化的概念出发，可以说肿瘤不仅是一种细 胞增殖异常的疾病，还是一种分化异常疾病。)
恶性肿瘤细胞在接触一种抗癌药后，产 生了对多种结构不同、作用机制各异的 其他抗癌药的耐药性。
P-gp
（三）、不良反应
• 骨髓抑制、 消化道反应（恶心、呕吐 ） • 脱发、心脏毒性、 呼吸系统毒性、 肝脏毒性、
肾和膀胱毒性、 神经毒性、过敏反应
第二节 常用抗恶性肿瘤药物
二、影响DNA结构与功能的药物
氮芥
[作用与应用] 选择性低，对静止期 细 胞亦有杀灭作用，为周期非特异性药物。 主要用于淋巴病和霍奇金病，疗效显著。
[不良反应] 最常见的急性反应为消化 道反应，严重的不良反应为骨髓抑制。 局部刺激性大，只能静注或腔内注射。
环磷酰胺（环磷氮芥）
[作用与作用机制] 需在体内经代谢 成有活性的磷酰胺氮芥后发挥烷化 作用。对S期作用明显。