5) Kunming , PLA General Hospital , Kunming 650032 , China)
Abstract To further elucidate the biological characteristics and the roles of guanine nucleotide2binding protein subunit beta 22like 1 ( GBLP) in response to propranolol ( PRO) ,co2immunoprecipitation and HPLC2CHIP2IT2 MSΠMS were used to screen and identity the GBLP interacting proteins in human umbilical vein endothelial cells. Seven proteins were shown to interact with GBLP , including casein α2S1 , casein α2S2 ,β casein , desmoglein 1 precursor α, 2enolase ,fructose2bisphosphate aldolase C and peroxiredoxin 2. These proteins actively involved in energy metabolism of the cell , suggesting that GBLP might participated in the regulation of antioxidation processes ,which correlated with the known biological functions of PRO. Key words propranolol ; human umbilical vein endothelial cell ; guanine nucleotide2binding protein subunit beta 22like 1 , GBLP ; co2immunoprecipitation
邱 峰1) , 毛小琴2) , 陈世知3) , 邱宗荫4) 3 , 贾雄飞5)
(1) 重庆医科大学附属第一医院 ,重庆 400016 ; 2) 云南省第一人民医院 ,昆明 650032 ;3) 重庆医科大学附属第二医院 ,
重庆 400010 ; 4) 重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室 ,重庆 400016 ;5) 解放军昆明总医院 ,昆明 650032)
体 1 (receptor of activated protein kinase C 1 ,RACK1) ,
收稿日期 : 2008208221 ; 接受日期 : 2008211205 重庆市自然科学基金项目 (No. CSTC22005BB5227) 3 联系人 Tel : 023268485727 ,E2mail : zongyin @gmail . com Received : August 21 ,2008 ;Accepted : November 5 ,2008 Supported by Natural Science Foundation of Chongqing ( No. CSTC2 2005BB5227) 3 Corresponding author Tel : (023) 68485727 E2mail : zongyin. cn @gmail . com
本研究分别用 PRO 对映异体作用于 HUVEC ,采 用蛋白质免疫印迹法 (Western 印迹) 、激光共聚焦扫 描显 微 镜 技 术 ( laser scanning confocal microscope , LSCM) 比较分析细胞内 GBLP 的表达情况和定位 ,再 以免疫共沉淀法 (co2immunoprecipitation) 和高效液相 色谱2芯片2离子阱串联质谱系统 ( HPLC2CHIP2IT2MSΠ MS) 筛选 、鉴定 HUVEC 中的 GBLP 相互作用蛋白. 希 望通过本研究 ,进一步了解 GBLP 的功能 ,以及在 PRO 生物学效应及立体选择性机制中的作用.
SDS2PAGE 垂 直 电 泳 槽 (Bio2Rad 公 司) 、EDAS 290 扫描仪 ( Kodak 公司) 、激光共聚焦扫描显微镜 (TCS 公司) 、高速冷冻离心机 (德国 Heraeus 公司) 、
DYCZ224D 垂直电泳槽 ( 北京六一仪 器 厂) 、HPLC2 CHIPΠMS、HPLC2CHIP ( Agilent 1100 Series HPLC systems) 、Ion Trap LCΠMSD trap 6300 质谱仪 (Agilent
ISSN 100727626 CN 1123870ΠQ
·技术与方法·
中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2009 年 3 月 25 (3) :276～281
免疫共沉淀结合微流控芯片技术筛选 GBLP 相互作用蛋白
Technologies) . 112 细胞培养
HUVEC 细 胞 株 培 养 于 含 10 %新 生 牛 血 清 的 RPMI21640 培养基 ,生长至对数期时进行传代 ;细胞 达到所需数量 ,并为对数期时 ,将密度一致的细胞分 为 2 组 ,分别用 80μmolΠL R ( + ) 2PRO 和 S( - ) 2PRO 作用细胞 2 h 后 ,收集细胞并计数. 113 细胞内 GBLP 的表达情况及定位 11311 蛋白质免疫印迹法分析 以β微管蛋白为 矫正上样量的内参蛋白. 取等量分别经 R ( + ) ΠS ( - ) 2PRO 处理的 HUVEC 总蛋白 (25 g) ,12 % SDS2 PAGE 分离 ;分离后的蛋白质转移至 PVDF 膜 ,用 5 % 脱脂奶4 ℃封闭过夜 ;加入 1∶300 稀释兔抗人 GBLP 多抗与 1∶5 000稀释兔抗人β微管蛋白单抗 ,室温孵 育 1 h ;加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG(1∶5 000) ,室温 孵育 1 h ; PBS 洗涤后 ,用化学发光法 ( ECL) 进行显 色 , Kodak EDAS 290 扫描仪成像. 样品中目的蛋白相 对含量以 A 表示 (A = 目的蛋白带发光强度Π同泳道 内参蛋白带发光强度) ,并比较各样品中的目的蛋白 质表达丰度差异 ,同时进行 t 检验. 11312 激光共聚焦扫描显微镜技术分析 将对数 生长期的细胞贴壁爬片后 ,分别用 80μmolΠL R ( + ) ΠS( - ) 2PRO 作用细胞 2 h ;0101 molΠL PBS (pH 712) 洗涤爬片 ,并依次如下处理 :4 %多聚甲醛室温固定 细胞 20 min ,滴加正常兔血清封闭液 ,室温 20 min ; 滴加兔抗人 GBLP 多克隆抗体 (1 ∶400 PBS 稀释) , 4 ℃过夜 ;滴加 Cy3 标记羊抗兔 IgG ,室温 2 h ;水溶 性封片剂封片 ,LSCM 观察细胞内 GBLP 表达和定位 情况. 114 免疫共沉淀法试验 11411 蛋白质样品制备 收集对照组 、R ( + ) 2PRO 组和 S( - ) 2PRO 组的细胞各 1 ×107 个 , PBS 洗涤 2 次 ,加入 1 ml 细胞裂解液 ; 同时设置不加兔抗人 GBLP 多克隆抗体平行对照. 11412 去除非特异性结合 分别取 200μl 上述蛋 白样品 ,蛋白质量约为 500μg ,加入约 1μg 与免疫沉 淀所用 IgG 同种属的正常兔血清 IgG 和 20 μl 充分 重悬的蛋白 A2琼脂糖 ,4 ℃缓慢摇动 3 h ,2 500 rΠmin 离心 5 min ,取上清液备用. 11413 免疫共沉淀 取 014 μg 兔抗人 GBLP 多克 隆抗体加入上清液 ,4 ℃缓慢摇动过夜 ; 加入 20 μl
Screening of GBLP2interacting Proteins with Co2immunoprecipitation
and an Integrated Microfluidic System
QIU Feng1) , MAO Xiao2Qin2) , CHEN Shi2Zhi3) , QIU Zong2Yin4) 3 , J IA Xiong2Fei5)
在过去的工作中 ,我们采用比较蛋白质组学策 略研究了普萘洛尔 (propranolol , PRO) 对映异构体 R ( + ) ΠS ( - ) 2PRO 诱 导 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 ( human umbilical vein endothelial cell , HUVEC) 蛋白质表达谱 差异 ,在所鉴定出的差异表达蛋白质中 ,发现 G 蛋 白 β 亚 基 2 样 1 蛋 白 ( guanine nucleotide2binding protein subunit beta 22like 1 , GBLP) 在 R ( + ) 2PRO 干 预后 的 HUVEC 中 高 表 达[1] . GBLP 是 新 近 发 现 的 RACK家族成员之一 ,又称为活化的蛋白激酶 C 受
摘要 为了进一步阐明 G蛋白β亚基 2 样 1 蛋白 (guanine nucleotide2binding protein subunit beta 22like 1 , GBLP) 在普萘洛尔 (propranolol ,PRO) 生物学效应发生机制中的作用 ,采用免疫共沉淀法结合液相 色谱2芯片2离子阱串联质谱 ( HPLC2CHIP2IT2MSΠMS) 系统筛选并鉴定人脐静脉内皮细胞 ( human umbilical vein endothelial cell ,HUVEC) 中的 GBLP 相互作用蛋白. 结果表明 ,有 7 种蛋白与 GBLP 存在 相互作用 ,分别为酪蛋白α2S1 、酪蛋白α2S2 β、酪蛋白 、桥粒芯蛋白 1 前体 、α2烯醇化酶 、果糖二磷酸 醛缩酶 C、硫氧还原蛋白过氧化物酶 2. 这些蛋白的生物信息学检索结果提示 , GBLP 可能参与了细 胞的能量代谢调节和抗氧化机制 ,与普萘洛尔的生物学效应发生机制密切相关. 关键词 普萘洛尔 ; 人脐静脉内皮细胞 ; G蛋白β亚基 2 样 1 蛋白 ( GBLP) ; 免疫共沉淀 中图分类号 Q51 ;Q633