•成功的 原因？
Klibanov 的实验
非水介质的组成
• 有机溶剂 • 超临界流体 • 气相介质
• 低共熔混合体系：两种或多种固体化合物混合而得到的具 有一个最低共熔点的状态。 • 热点：介质工程、溶剂工程
• 改变反应介质来改变酶催化反应的选择性，从而达到人为 的改变和控制酶的立体专一性。
第一节 有机介质中的酶促反应概述
一 必需水
庚猪 醇胰 的脂 转肪 酯催 反化 应甘 油 三 丁 酸 酯 和 正
必需水
一 必需水
1 概念：
紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量
水称为必需水
2 ．干燥的酶水合过程：
• 溶菌酶为例：
• （1） 结合水量在0-7%g/g（水/酶）， • （2）结合水量在7-25%g/g（水/酶），
• 2 向反应体系中直接加一种水合盐
• 3 向每一溶剂中加入不同量的水
水活度缓冲体系
二 酶的选择
• 1 酶参加的反应：合成反应、转移反应、醇解反应、 氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应 • 参加反应酶的种类选择除与反应类型有关，还与酶-底
物、产物-溶剂间关系有关。
常用酶的分类
• （1） 氧化还原酶类：
利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备 具有结合该配体及其类似物能力的新酶称为生物印迹酶
有机相生物印迹酶
为什么在有机相中会产生印迹现象？
水
刚性
有机相生物印迹酶
水在酶催化反应中的作用
• 水直接或间接参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用
•
水充当了酶结构的“润滑剂”，使酶分子的柔性增强
有机相生物印迹酶
反胶束体系中的含水量
C．基本原理：“水壳”模型
• 反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。 • 结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水
• 自由水即为存在于水相中的那部分水
“水壳”模型
• 水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较 多。 • 1.从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分
2．酶形式的选择
• （２） 化学修饰酶：
2．酶形式的选择
• （３） 固定化酶：
• 把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠
等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反 应速度、热稳定性等都可提高。
2．酶形式的选择
• （３） 固定化酶：
有机相中固定化后载体对酶的影响
• A.载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底物和 产物的局部浓度。
冻干
枯草杆菌 蛋白酶
（2）
在辛烷中催化酯化反应的速度比较：
反应（1）中得到的酶比反应（2）中得到的酶高100倍
在水溶液中其活性 ： 相同
有机相生物印迹酶
酶的水解活力与溶解酶的缓冲液pH值有很大关系
有机相生物印迹酶
概念：
酶在含有其配体的缓冲液中，肽链与配体之间的氢键等 相互作用使酶的构象改变，这种新构象除去配体后在无水 有机溶剂中仍可保持，并且酶通过氢键能特异地结合该配 体，这种方法叫生物印迹。
度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的
系统。
概念表面活性剂
• 表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和
亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。
• 在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂： • AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸 钠。
概念临胶束浓度
• (1). 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反
应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附 近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。)
相容性
• 例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互
溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶 之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二
一 有机介质中酶催化的应用
• 酶 • 脂肪酶 催化反应 肽合成 酯合成 转酯 聚合 应用 青霉素G前体肽合成 醇与有机酸合成酯类 各类酯类生产 二酯的选择性聚合
酰基化
甘醇的酰基化
二． 有机相酶反应的优点：
• 1． 有利于疏水性底物的反应，能催化在水中不能进
行 的反应
• 2． 可提高酶的热稳定性. 3． 可改变反应平衡移动方向 • 4. 可控制底物专一性 • 5. 酶和产物易于回收。 • 6. 可避免微生物污染。
B.反胶束体系的制备
• 将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度 超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶剂内形成
聚集体，这种聚集体则为反胶束。
反胶束体系的制备
影响因素
• 反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而
变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。
• 反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。Wo的定义 为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即 有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之 比。
非水介质的酶促反应
生物工程学院 常雅宁
第四章 非水介质中的酶反应
• 第一节 有机介质中的酶促反应概述 • 第二节 有机介质中酶促反应的条件 • 第三节 有机介质对酶性质的影响 • 第四节 有机介质中酶促反应应用（生物能源） • 第五节 超临界流体中的酶促反应
有机相酶催化历史
• 古代： • Hill.A.C(1898)J.Chem.Soc,73,634-658 • Kastlc,J.C.and LocvCnhart,A.a.(1900)Am Chem,J,24, 491-525 • Sym,E,A(1933)Biochem,Z,258,304-324 • Sym,E,A(1936)Enzymologia 1,156-160
三. 研究热点
• 仿水溶剂和印迹技术 • （1） 仿水溶剂体系 • （2） 分子印迹技术
（1） 仿水溶剂体系
• 思路：水在酶催化反应中的作用（具有高介电常数和
形成氢键的能力）
结论：有机溶剂可以替代部分水
（1） 仿水溶剂体系
• 概念
• 可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性 添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影 响酶的活性和立体选择性。称为仿水溶剂体系。
• 一．有机介质酶反应的应用现状 • 二. 有机介质酶反应的优点 • 三. 有机介质酶研究热点 • 四. 有机介质酶反应具备条件
一 有机介质酶反应的应用现状
• 酶
• 蛋白酶
催化反应
肽合成 酰基化
应用
合成多肽 糖类酰基化
羟基化酶
过氧化物酶 胆固醇氧化酶 醇脱氢酶
氧化
聚合 氧化 酯化
甾体转化
酚类、胺类化合物的聚合 胆固醇测定 有机硅醇的酯化
• （3）结合水量在25-38%g/g（水/酶），
• （4） 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖
2 ．酶活与水的关系：
• 酶活最大时——蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性 （柔性）之间达到最佳平衡点。
• “刚柔并济”
•
3．影响酶必需水含量的因素（酶和溶剂）
a．不同酶需水量不同
• 在辛烷中糜蛋白酶催化仅需吸附50个水分子，而脂肪
有机相中刚性增强原因？
四． 有机相酶反应具备条件
• 1． 保证必需水含量。
• 2． 选择合适的酶及酶形式。 • 3． 选择合适的溶剂及反应体系。 • 4． 选择合适pH值。
第二节 有机介质中酶促反应的条件
• 1． 保证必需水含量
• 2． 选择合适的酶及酶形式
• 3． 选择合适的溶剂及反应体系
• 4． 选择最佳pH值和离子强度
•失败的 原因？
有机相酶催化历史
• 近代有机相酶催化研究再次起飞的里程碑 • Zaks,A.and Kilbanov,A.M(1984),Science224,1249-1 251 • ZoKs,A. and Kilbanov,A.M.(1985),Proc.Natl,Acad,Sc i.u.s.a.82,3192-3196
双相体系与水相体系中产物纯度的比较
双相体系中，由于乙酸丁酯对产物苯乙酸的萃取，促进 了酶反应的平衡，使得L-型底物的转化率为99.95％，
而这样得到的D-叔亮氨酸的纯度也提高到99.5％。
2． 有机溶剂影响酶催化的方式
• (1） 有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活
A 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度
子的水层。
• 2.α -糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中的特性很相象。 • 3.反胶束中酶显示的动力学特性接近于在主体水中的特性。
构建双水相体系实现在线产物分离
Top phase Product
Substrates
Biocatalyst
Product
Side product
Bottom phase
B 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活 性下降。 C 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。
2． 有机溶剂影响酶催化的方式
• （2） 有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活
2． 有机溶剂影响酶催化的方式
• （3） 有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用。
3．选择有机溶剂必须考虑因素
有机相中固定化后载体对酶的影响
• B.载体影响酶分子上的结合水 • 通过选择合适的载体可使体系中的水进行有利分配。
有机相中固定化后载体对酶的影响
• C.通过载体与酶之间形成的多点结合作用，可稳定酶 的催化活性构象。
有机相中固定化后载体对酶的影响
• D.酶动力学影响一个酶同时催化的两个反应的相对速
• （2 ）水解酶类
• （3 ）异构酶
2．酶形式的选择
• 两大类：
• 第一类是固态酶，冷冻干燥的酶粉和固定化酶，结晶 酶